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       【摘要】 
       目的探讨自发形成的稳定囊泡作为药物载体的实用性。方法用两性表面活性剂DSB与阴离子表面活性剂AOT按一定比例复配自发形成稳定囊泡，用负染色透射电镜和动态光散射进行表征;并以其作为药物瑞香素的载体。用一阶导数分光光度法测定包封率，用透析法测定其在模拟胃液和模拟肠液中的释放率。结果在表面活性剂总浓度为1.5×10-2mol/L,DSB/AOT=5∶5时，囊泡粒径最大为169.1 nm，包封率最高为28.2%,在模拟胃液中和模拟肠液中释放75%的时间分别为120 min和440 min。结论自发形成的稳定囊泡是一种具有潜在实用性的药物载体。
       【关键词】  囊泡;瑞香素;粒径;包封率;释放率
       双亲分子溶液中在一定条件下会自发形成有序分子结构体系，其中有一种是双分子层膜封闭形成球形或椭球形的单室或者多室类的缔合结构。一般说来，由合成表面活性剂所形成的称之为囊泡，而由天然磷脂所形成的称之为脂质体。制备囊泡或脂质体传统的方法是由外界提供额外的能量，如挤压法、超声波法[1]等。这些方法得到的囊泡是热力学不稳定体系，为此自发形成囊泡就成为研究人员追求的目标。1989年，Kaler和Zasadzinski[2]从复配的阴阳离子表面活性剂体系得到了自发形成的囊泡。这种自发囊泡为合成纳米材料[3]，传感器[4]、药物载体[5，6]等应用创造了条件。目前，非离子表面活性剂囊泡作为药物载体的研究，国内已有相关报道[5～8]，然而这些囊泡体系的形成需要外力作用，其稳定性不好，所以限制了其作为药物载体的应用。复配体系自发形成囊泡不需要外力作用，是热力学的稳定体系，目前作为药物载体研究还很少，复配体系自发形成的囊泡，其大小、表面电荷、渗透性等可以通过表面活性剂的疏水链长和复配比例的改变予以调节，作为药物载体具有广泛的应用前景[9]，我们首次用两性表面活性剂(DSB)和阴离子表面活性剂(AOT)复配获得自发形成囊泡，着重研究盐的浓度对其影响[10]。由于甜菜碱型表面活性剂DSB和AOT都已经分别用于医药领域和药物载体[11，12]，因此这种囊泡极有可能成为一种药物包封和缓释的药物载体。本文通过改变两种表面活性剂比例在缓冲溶液中得到系列囊泡，采用透射电镜和动态光散射对囊泡形态进行了表征。然后对瑞香素的包封率及其缓释作用进行了研究。瑞香素(daphnetin)又称祖师麻甲素，是微溶于水的一种香豆素类化合物。其分子结构如图1所示。瑞香素临床上主要用于治疗血栓堵塞性脉管炎、风湿性关节炎、冠心病以及用作中药麻醉剂[13]。
       1仪器与材料
       透射电镜(TEM，型号JEM-1200EX);动态光散射(DLS，型号BI-200SM，Brookhaven Instruments Co.，Holtsville，NY);BI-9000AT数字相关器;UV-2100型紫外/可见分光光度计(北京瑞利分析仪器公司)。透析袋(孔隙大小相当分子量8000~10000蛋白质，山东济南市爱伯公司);两性表面活性剂十二烷基羟丙基磺基甜菜碱(DSB,C12H25-N+(CH3)2-CH2CH(OH)CH2-SO3Na)，南京金陵石化研究院提供，二次提纯，纯度>98.0%;阴离子表面活性剂二(2-乙基已基)琥珀酸磺酸钠(AOT),Fluka Co., 纯度>98.5%;瑞香素粗品(长春春城制药厂);水为三次蒸馏水;其余无机试剂均为分析纯试剂;模拟胃液(pH=1.2)、模拟肠液(pH=7.5)、磷酸二氢盐和磷酸氢二盐缓冲溶液(PBS;pH=7.4)均按文献[7]配制。图1瑞香素的分子结构
       2方法
       2.1囊泡的制备及囊泡形态的观测配制DSB和AOT的母液，分别取适量的表面活性剂溶液混合至目标比例和浓度，轻微摇晃均匀，混合体系呈现淡蓝色，预示着囊泡的自发形成[10,14]。采用负染色法透射电镜对囊泡进行观测。
       2.2囊泡粒径的测定动态光散射的入射波长为488 nm。在温度为25℃，散射角为90°等条件下进行测定。
       2.3瑞香素的纯化参见文献[13]
       2.4瑞香素及空白囊泡溶液的紫外-可见光谱精确配制含5.0×10-3mol/L的瑞香素溶液及表面活性剂总浓度Ctotal=1.5×10-2mol/L的空白囊泡溶液，在UV-2100型紫外/可见分光光度计上从220～450 nm间进行扫描。扫描结果表明瑞香素在325，263 nm处有吸收峰(图2中1，2两处)，与文献[13](324，262 nm)相吻合。瑞香素在325 nm处吸收峰明显且峰形好，为此本文选用325 nm作为瑞香素缓释率测定。由于测定包封率是囊泡及药物一起测定，为了避免囊泡对药物的干扰，我们同时在相同的波长范围内测定了瑞香素溶液和空白囊泡的一阶导数光谱。结果见图3。图3的a线是空白囊泡的一阶导数曲线，其基本为一直线。b线为波形，是瑞香素的一阶导数曲线，从1，2，3，4四个峰形来看，选择3处波长(即306 nm)测定瑞香素的导数值时，空白囊泡对药物分子基本不产生干扰。故本文选用306 nm为瑞香素一阶导数值的测定波长，在此应用于测定囊泡对瑞香素的包封率。a 空白囊泡;b 瑞香素图2瑞香素和空白囊泡紫外光谱谱图a 空白囊泡b 瑞香素图3瑞香素和空白囊泡的一阶导数紫外光谱谱图
       2.5瑞香素一阶导数标准曲线和零阶导数标准曲线精确配制系列浓度瑞香素溶液，在306 nm处测定一阶导数值得标准曲线，线性方程为(1)式，在325 nm处测定零阶导数值得标准曲线，线性方程为(2)式。C=0.0942A + 2×10-6(mg/ml) R2=0.999 3(1)C=0.0195A -0.0001(mg/ml) R2=0.999 8(2)
       2.6样品的制备及包封率的测定向试管中加入4 ml 0.005 mol/L(含瑞香素0.356 mg)的瑞香素溶液后，分别从配制好的DSB和AOT母液中，按一定比例取量，但保持两者总浓度(Ctotal=0.015 mol/L)不变。轻微振荡试管后，得到淡蓝色的含药物瑞香素的囊泡溶液。本实验选择一阶导数分光光度法测定药物包封率，它具有快速、准确、方便等特点[15]。将制备好的瑞香素包封溶液，在306 nm处测定它们的导数值，代入(1)式中计算游离药物的质量后，按(3)式计算包封率。包封率(%)=(1-游离药物质量药物总量)×100%(3)
       2.7囊泡中瑞香素的释放率研究药物缓释率的测定通常采用透析法[7]。取10 ml包封药物囊泡溶液置于透析袋内，加入与袋外相同的模拟胃液或模拟肠液以维持透析袋内外的离子强度相等。将透析袋放入盛有100 ml模拟胃液或模拟肠液的广口瓶中置于37℃水浴，袋外开始轻微搅拌。每隔一定时间，从袋外取2 ml透析液在325 nm处测量吸光度，然后放回到瓶中，直至吸光度不变为止，解开透析袋，将全部溶液倒入瓶中，测其吸光度。按同样方法，将同浓度瑞香素直接放入袋内，测定不同时刻的吸光度。测量结果代入式(2)计算出某一时刻释放药物的质量，再按(4)式计算缓释率。从而得到瑞香素囊泡包封物和纯的瑞香素溶液的释放情况。缓释率(%)=t时刻包封在囊泡中药物通过渗透膜的药量t时刻未包封药物通过渗透膜的药量×100%(4)
       3结果与讨论
       3.1囊泡制备的表征
       3.1.1负染色照片从负染色照片(见图4)可看出，未包药的囊泡呈大小较为均匀的圆形，含药囊泡的形状也为圆形，但粒径分布不均，这与下列表1光散射所得数据是吻合的。同时TEM照片也有力地证实了囊泡的存在。a 空白囊泡b 包封瑞香素的囊泡(DSB/AOT=5:5,Ctotal=0.015 mol/L)图4DSB/AOT囊泡负染色TEM照片
       3.1.2囊泡的粒径和多分散度的测定使用动态光散射来测定不同配比的囊泡体系及瑞香素囊泡包封物的粒径。结果见表1。表1不同配比时DSB/AOT囊泡的粒径和多分散度从表1中数据可知，空白囊泡和载药囊泡的粒径均随DSB比例的增大，囊泡的粒径先增加，而后减少。囊泡的粒径随着DSB比例的增大先增加后降低，这可以通过曲率来解释。单独的AOT分子聚集形成胶束;当适量的DSB分子加入AOT分子中，由于两种分子相互作用且满足了囊泡形成对于分子结构的需要，从而改变了聚集体的曲率。但DSB分子的体积比AOT要大，因此当达到一定比例时囊泡的粒径开始增加。DSB含量继续增加，曲率继续减小，在两者比例为1/1时粒径最大。进一步增大DSB分子，可能导致囊泡双层膜不稳定而引起分子的重组，于是粒径减小。含瑞香素囊泡包封物的粒径比空白囊泡在相同比例下要大一些，其粒径增大，这是由于瑞香素增溶于囊泡双层之中。载药囊泡的多分散度较大，说明囊泡粒径分布不均匀，这与图4b的负染色照片是一致的。
       3.2囊泡的包封率研究
       3.2.1囊泡的组成对包封率的影响在药物质量均为0.356 mg及表面活性剂总浓度均为Ctotal=0.015 mol/L的条件下，改变DSB与AOT的比例，研究了DSB/AOT(mol/mol)分别为1∶9，2∶8，4∶6，5∶5，6∶4时囊泡的包封率。结果见图5。由图5可知随着两性表面活性剂DSB比例的增加，囊泡对药物瑞香素的包封率也逐渐增大，然后降低，这与相应的粒径变化是一致的。当DSB/AOT=5∶5空白囊泡粒径最大为169.1 nm，而含瑞香素囊泡包封物的粒径为194.7 nm，此时药物的包封率也达最高为65.2%。比文献[16]报道的一般药物囊泡包封率10%~50%高。从实验结果可知，在这5个比例下形成的囊泡对药物瑞香素都具有较高的包封率，即使是在DSB/AOT=6∶4包封率最低时，其包封率也高达45.4%，说明这种体系形成的囊泡对瑞香素具有较好的包封效率。图5不同组成和粒径对包封率的影响图6介质pH对包封率的影响
       3.2.2pH对囊泡包封率的影响在药物质量均为0.356mg，表面活性剂总浓度为Ctotal=0.015 mol/L，DSB/AOT=5∶5的条件下，配制不同pH的瑞香素囊泡包封物溶液，在室温下测定样品包封率。结果如图6所示。由实验可知，随着pH的增大，囊泡的包封率逐渐增大，当pH达到7.4时包封率最大达到65.2%，然后包封率略有下降。瑞香素微溶于水，若pH稍有增加，使其7位羟基解离，略带电荷，提高其溶解度，有利于囊泡的增溶量增加。若pH进一步增加，不仅使7位羟基解离度增大，还可能8位羟基开始解离，这样药物分子负电性增强，则受到囊泡双层膜的负电荷排斥，不利于其增溶。两种相反作用的结果，使增溶量随pH变化呈马鞍型。
       3.2.3温度对囊泡包封率的影响在药物质量均为0.356 mg，表面活性剂总浓度为Ctotal=0.015 mol/L，而DSB/AOT=5∶5的条件下，将瑞香素囊泡包封物在25，30，35，45，55，65℃测定其包封率，结果如图7所示。由实验结果可知当温度升高到45℃时，瑞香素的包封率显著的降低，然后变化缓慢。这种变化可能与囊泡双层膜的相变有关，当温度升高到一定温度，AOT分子碳氢链失去全反式构象[17]，变为准流体，正如文献[18]指出此时溶质通过双层膜的速度明显提高，从而引起了包封在囊泡中的药物渗漏明显加快。图7温度对包封率的影响
       3.3囊泡缓释效率的研究药物质量均为0.356 mg，以DSB/AOT=5∶5;4∶6;2∶8(mol/mol)，表面活性剂总浓度Ctotal=0.015 mol/L的囊泡包封物分别测定在模拟胃液和模拟肠液中的释放，在各种条件下的药物释放曲线如图8所示，不管是在模拟肠液还是在模拟胃液中，没有载体的药物释放最快。同时从图8可知药物在胃液中释放时间不如肠液长，例如在DSB/AOT=5∶5体系中，以药物释放75%为例，在胃液和肠液中释放时间分别是没有载体时的3倍(120 min)和4.4倍(440 min);在DSB/AOT的组成配比上，以5∶5的缓释效率最好。图 8囊泡包封物在模拟胃液(a)和模拟肠液(b)中的缓释曲线
       4结论
       通过上述研究发现，DSB/AOT体系自发形成的囊泡作为药物载体其粒径、包封率、缓释率大小可以随复配表面活性剂的比例而调节，该体系对药物瑞香素具有较高的包封率和较好的缓释作用，高温对包封率有较大影响。在表面活性剂总浓度为Ctotal=0.015 mol/L，表面活性剂DSB/AOT=5∶5时，其包封率最高可达65.2%，是一种具有潜在实用性的药物载体。
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