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       【摘要】 
       目的在肝郁证大鼠模型代谢组学研究基础上，进行逍遥散治疗肝郁证大鼠模型的方证代谢组学研究，探讨逍遥散治疗机制及进一步明确肝郁证的代谢组学特征。方法24只Wistar大鼠随机分为逍遥散+模型组、逍遥散+空白组、模型组、正常对照组，每组6只。逍遥散+模型组和模型组采用慢性束缚的方法造模，逍遥散+模型组和逍遥散+空白组同时用逍遥散灌胃，第22天采血检测血浆皮质酮，运用1H NMR技术对4组大鼠血清进行代谢组学分析。结果模型组大鼠第15天，22天体质量增长缓慢，显著低于其它三组(P均<0.01);4组血浆皮质酮存在差异(P<0.001)，浓度从高到底依次为模型组、逍遥散+模型组、逍遥散+空白组和正常对照组，组间比较模型组显著高于逍遥散+模型组及其它两组(P<0.01)。代谢组学分析表明，4组样本间沿第1主成分(t1)方向有明显的分组差异，其中逍遥散+空白组与正常对照组之间稍有差异，而逍遥散+模型组与正常对照组样本的差别较大，模型组与正常对照组样本的差别最大，且物质的变化大多呈单向改变。结论逍遥散对肝郁证的治疗作用在代谢物水平并非仅仅简单的上调、下调从而中和模型造成的代谢物变化，而可能是通过对机体的整体调节发挥治疗作用。通过方证整体研究，找出随证候模型和相应方剂治疗后变化一致并趋于正常的物质，可能较好地代表证候的代谢组学特征，从而更适合于中医证候研究。
       【关键词】  肝郁证;代谢组学;1H核磁共振;大鼠模型;方证研究
       方证研究是中医证候研究的特色，以证选方，以方测证，方证之间紧密联系，有极强的客观性和科学性。将方证作为一个整体去研究，可以克服一般证候的模糊性和恒动转移性，更能有效地展示证本质。通过观察某一证型在相应方药治疗前后临床症状的改善，不仅证实对原证候辨证的准确性，同时也说明所选方药是对“证”的;也就是通过“疗效”这个中心环节，同时证明“方”和“证”的科学性，这是由中医学理论理、法、方、药的一致性和整体观决定的;通过方证的整体研究从正反两个方向挖掘证的科学内涵，其同一性变化更能代表某一证特异性的变化。在成功建立“肝郁证”大鼠模型并对其进行代谢组学的初步研究基础上[1]，本课题组继而运用代谢组学方法对“肝郁证”的方证进行整体研究，以期进一步揭示肝郁证的科学本质。
       1材料与方法
       1.1动物与材料实验用清洁级雄性Wistar大鼠24只，体质量(150±20)g，购自南方医科大学实验动物中心。适应性饲养1d后随机分为模型组、正常对照组、逍遥散+模型组和逍遥散+空白组共4组，每组各6只。正常对照组3只1笼，其余3组单笼孤养。恒定温度(21±3)℃，光-暗周期为12 h，动物自由摄食及饮水。逍遥散制剂：按《太平惠民和剂局方》原方比例调配(每剂中含柴胡12 g，当归、白芍、白术、茯苓各10 g，生姜6 g，炙甘草3 g，薄荷3 g)，药物加10倍于药材量的水浸1 h后，加热煮沸1 h，过滤后，再加水煮沸40 min，于80℃恒温水浴中浓缩成含生药量1 g/ml，存于-4℃冰箱备用。药材购于南方医院中药房，经中医药学院中药教研室鉴定为正品药材;中药煎液由南方医科大学中医药学院中药制剂教研室制备。
       1.2 造模和干预参照严灿等[2]慢性束缚的方法，将模型组和逍遥散+模型组大鼠置于特制的束缚制动筒内，通过移动插片逐步缩小大鼠的活动空间，调节到其不产生强烈反抗的最小空间。每日开始时间随机，束缚制动1次/d，持续时间从第1天的4 h逐渐增至6 h/d，连续21 d。模型组和逍遥散+模型组大鼠在束缚制动期间禁食、禁水。逍遥散+模型组和逍遥散+空白组大鼠根据正常成人逍遥散每日用量，按体表面积换算成大鼠用药量为10 g/(kg·d)，根据个体体质量每日上午8时给逍遥散+模型组和逍遥散+空白组大鼠经胃灌相应药量。
       1.3取材造模第21天4组大鼠均禁食不禁水，造模第22天各组大鼠用10 %的水合氯醛腹腔注射，打开腹腔由腹主动脉采血约8 ml，抽取的血浆室温下静置2 h，3 000 r/min离心共10 min，取上游血清-40℃冰箱保存待检。
       1.4行为学观察和血清皮质酮检测造模期间观察大鼠行为、反应、排便、饮食等一般情况的变化，并在第8，15，22天称取体质量进行比较。大鼠皮质酮酶联免疫分析试剂盒购自USCN LIFE(Catalog No.E0540r)，按说明书步骤检测4组大鼠血清皮质酮含量。所得数据以±s表示，用统计软件 SPSS13.0分别进行重复测量方差分析和单因素方差分析，LSD组间比较，以α= 0.05为显著性水准。
       1.5 代谢组学检测分析运用1H NMR技术对4组大鼠血清进行驰豫编辑实验(CPMG)和扩散编辑实验(LED)核磁共振实验，分别观测血清中的小分子代谢物和脂类代谢产物。对一定区间内的谱图按每段0.04 ppm的宽度进行分段积分，其中CPMG数据积分范围为δ0.4~ 4.4;LED数据积分范围为δ0.2~6。将积分按每张谱的总积分强度归一化。所得积分数据输入到SIMCA-P+软件(v10.04, Umetrics, Ume, Sweden)进行分析。数据采用Pareto标度化(Pareto scaling)进行预处理之后采用主成分分析(PCA)或偏最小二乘-判别分析(PLS-DA)。分析结果以得分图和载荷图表示。
       2结果
       2.1一般观察 逍遥散+模型组、模型组大鼠在造模第1周表现为易激惹、挣扎，随着造模的继续，第2、第3周模型组表现为躲避、活动减少和对外界刺激反应减少，安静时埋首、拱背，大便松散，皮色失去光泽;而逍遥散+模型组灌服逍遥散后也有活动减少表现，但对外界刺激反应与逍遥散+空白组、正常对照组大鼠无明显区别，大便便质未见明显异常，活泼度好于模型组大鼠。重复测量方差分析显示，随着造模和药物干预的进行，各组间在第15天，22天体质量出现显著性差异(P值分别为0.002，0.005)，其中模型组最低，逍遥散+模型组经药物干预后好于模型组组，逍遥散+空白组和正常对照组体质量增加较好。表明模型造成大鼠体质量增加缓慢，而逍遥散能改善这种情况(见表1)。表1各组大鼠体质量变化比较
       2.2血浆皮质酮检测各组大鼠第22天血浆皮质酮水平比较有显著性差异，其中模型组、逍遥散+模型组皮质酮水平显著高于未造模处理的逍遥散+空白组和正常对照组，但逍遥散+空白组与正常对照组组之间差异无统计学意义，同样造模的逍遥散+模型组与模型组间也无明显差异(P=0.494)。结果见表2。表2各组大鼠血浆皮质酮浓度比较
       2.3 代谢组学分析结果笔者此前已就模型组与正常对照组大鼠血清代谢组学进行比较，与正常对照组相比，模型组血浆中12种物质发生浓度变化，含量升高的Glucose、Cr，含量下降的有3-HB，Gln，Glu，Lac，NAc，OAc，UFA，VLDL/LDL，PCho和PtdCho[1]。其中哪些物质更能代表“肝郁证”模型的代谢组学特征，逍遥散治疗肝郁证的机制是什么?为此分别比较逍遥散+模型组与模型组间代谢物差异，了解逍遥散干预后模型大鼠血清代谢组学的变化;同时考虑到逍遥散本身对代谢组学的影响，比较逍遥散+空白组与正常对照组间代谢组学差异;最后将4组血清代谢组学同时比较，分析物质变化规律。
       2.3.1逍遥散对肝郁证模型大鼠血清代谢组学的影响比较逍遥散+模型组与模型组间代谢物差异，以明确肝郁证模型大鼠经逍遥散干预后哪些代谢组分趋于正常。两组样本的CPMG实验PLS-DA分析结果见图1;LED实验PLS-DA分析结果见图2。A-得分图B-载荷图图1逍遥散+模型组与模型组血浆CPMG核磁共振氢谱的PLS-DA分析结果图逍遥散+模型组与模型组两组样本间有明显的分组差异(图1A、2A)。综合CPMG实验分析(图1B)和LED实验分析(图2B)的结果可以得出发生浓度差异变化的主要物质。结果见表3。A-得分图B-载荷图■ 逍遥散+模型组● 模型组图2逍遥散+模型组与模型组血浆LED核磁共振氢谱的PCA分析结果图表3逍遥散+模型组与模型组大鼠血清CPMG和LED谱中发生浓度变化的相关代谢物
       2.3.2 逍遥散对大鼠代谢组学的影响比较逍遥散+空白组与正常对照组间代谢组学差异，明确逍遥散本身对大鼠代谢组学的影响，CPMG实验PLS-DA分析结果见图3;LED实验PLS-DA分析结果见图4。A-得分图B-载荷图图3逍遥散+空白组与正常对照组血浆CPMG核磁共振氢谱的PLS-DA分析结果图逍遥散+空白组与正常对照组间有明显的分组差异(图3A、4A)。综合CPMG实验分析(图3B)和LED实验分析(图4B)的结果可以得出发生浓度差异变化的主要物质。结果见表4。
       2.3.34组大鼠血清代谢组学比较同时进行4组大鼠血清代谢组学的比较，对模型和逍遥散两个因素各自造成的代谢组学影响初步判定并比较，在总体上把握逍遥散治疗后模型大鼠血清代谢组学的变化趋势。4组血清样本的CPMG NMR谱图见图5，OSC-PLS分析结果见图6;LED NMR谱图见图7;OSC-PLS分析结果见图8。A-得分图B-载荷图■ 逍遥散+空白组 ● 正常对照组图4逍遥散+空白组与正常对照组血浆LED核磁共振氢谱的OSC-PCA分析结果图表4逍遥散+空白组与正常对照组大鼠血清CPMG和LED谱中发生浓度变化的相关代谢物图54组大鼠血清的CPMG NMR谱图A-得分图B-载荷图图64组大鼠血清CPMG核磁共振氢谱的OSC-PLS分析结果图从上图可以看出，4组样本间沿第1主成分(t1)方向有明显的分组差异(图6A，8A)，其中逍遥散+空白组与正常对照组组之间稍有差异，而逍遥散+模型组与正常对照组样本的差别较大，模型组与正常对照组组样本的差别最大。物质的变化大多呈单向改变(图5，7)，即其余3组波谱与空白对照组相比，存在差异物质的波峰同时降低或升高，并且模型组波谱峰与正常对照组比较差异最大，而逍遥散+空白组最小。4组样本间的主要差异物质见表5。
       3讨论
       肝郁证状态下，机体神经内分泌功能紊乱，下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴兴奋，会出现生长的缓慢和血浆皮质酮增高[3，4]。本实验观察到4组间体质量增加存在显著性差异，其中模型组体质量增长最慢;也观察到逍遥散+模型组体质量增长减慢，但由于逍遥散的干预该情况得到了改善，好于模型组。皮质酮检测显示模型组最高，与其余3组相比有显著性差异;逍遥散+模型组也有一定程度升高，高于正常对照组，但经逍遥散干预后得到了改善，已经显著低于模型组了。从体质量增长和血浆皮质酮观察来看，模型组变化最大，逍遥散+模型组经逍遥散干预后这些变化得到改善，而逍遥散+模型组变化不大，与正常对照组接近。说明逍遥散对肝郁证大鼠具有治疗作用，但对正常大鼠影响不大。图74组大鼠血清的LED NMR谱图A-得分图B-载荷图逍遥散+模型组(▲)、逍遥散+空白组(※)、模型组(■)、正常对照组(●)图84组大鼠血清LED核磁共振氢谱的OSC-PLS分析结果图表53组大鼠血清CPMG及LED谱中与空白对照组比较代谢组学是通过对机体体液中代谢产物定量和定性分析从整体上评价生命体功能状态及其变化，反映的是基因、环境、致病因素、营养、药物、时间等诸多因素综合作用于机体后的总的反应。在中医证候的代谢组学研究中，较少采用治疗药物和/或阳性药物进行干预、比较，正是因为药物本身可能对机体代谢物造成影响，导致治疗组、阳性药物组、模型组之间缺乏可比性。本研究根据代谢组学的特点，特意加设空白+逍遥散组，希望了解逍遥散对正常大鼠的代谢组分的影响，从而在探讨逍遥散对肝郁证模型大鼠的治疗作用时，排除药物本身对代谢组分的影响，凸显证候造成的代谢组学变化规律。通过对肝郁证模型大鼠方证的整体研究，发现逍遥散能造成正常大鼠血清代谢组分的改变，发生变化的主要是第2组分方向(图3A，4A)，但这种影响相对于肝郁证模型而言就小得多。因为在进行所有4个组的同时分析时，我们能够看到模型组与正常对照组差异最大，逍遥散+空白组与正常对照组差异最小(图6A，8A);逍遥散给药之后模型大鼠的代谢谱有所变化，向正常组靠近，表明逍遥散有治疗作用，这与上述常规观测的结果一致。
       通过各组之间进行两两比较，从不同角度观察逍遥散和模型两个因素对大鼠血清代谢物的影响;对各组比较中变化物质的关系进一步比较、分析，并参考四组同时比较的波谱图波峰变化情况(图5，图7)，可以更加清楚代谢物质在各组大鼠中变化的趋势和幅度，从中我们明确了以下物质的变化趋势(见表6)。表63组大鼠血清CPMG、LED谱中与正常对照组比较　表6中大多数物质呈单向变化，变化幅度仍以模型组最显著，逍遥散+空白组最小，这与图6A、8A观察到的一致;逍遥散和模型虽然都造成上述物质的同向变化，但当两个因素同时作用于大鼠时，其效应并未相加，而产生了相减——治疗作用。显然逍遥散的治疗靶点不是这些小分子物质，推测它是通过对机体的整体调节发挥治疗作用。作为代谢产物的这些小分子物质的变化不足以表明逍遥散的治疗机制，但却能说明逍遥散的疗效，因为通过逍遥散对模型大鼠的干预，它们的代谢组分趋于正常化。以方测证，那么逍遥散正是治疗了对应的肝郁证，从而在代谢组学结果上得到改善，进一步证明了模型的可靠性;同时，既然肝郁证模型引起相应代谢组分的改变，而通过相应方剂逍遥散治疗后，其中变化的部分代谢组分趋于正常，那么是不是这部分趋于正常的代谢组分更能代表肝郁证模型的代谢组学特征呢?我们也看到，逍遥散干预后的模型大鼠某些代谢组分差异更加明显，这种变化与逍遥散本身的影响也毫无关系(如NAc，见表6);既然它的变化与方证毫无关系，因此无法代表肝郁证模型的代谢组学特征。根据以上分析，笔者推测肝郁证大鼠模型差异表达的12种血清代谢物质中，Lac、Cr、Glucose、3-HB、Glu、VLDL/LDL、PtdCho、UFA这8种物质也许更能体现肝郁证模型大鼠血清代谢组学特征，是肝郁证代谢标志物群的重要组分。
       本研究设置了药物对正常大鼠干预组，以此了解药物本身对代谢组学的影响，从而在方证互参的比较中，考虑药物自身对代谢组分的影响，找出随证候模型和相应方剂治疗后变化一致并趋于正常的物质，剔除那些变化与方证无关的物质;通过方剂的疗效证明证候模型的可靠性，通过对证候模型采用相应方剂干预并进行代谢组分的变化趋势分析，明确证候的代谢组学特征。
       【参考文献】
         　　[1]徐舒,颜贤忠,吕志平,等. 肝郁证大鼠模型的建立及代谢组学的初步研究[J].中华中医药杂志，2009,24(6):54.
       
       [2]严灿, 徐志伟, 吴丽丽, 等. 建立中医情志致病动物模型的思考[J].中国临床康复，2006,10(3):155.
       
       [3]Raone A, Cassanelli A, Scheggi S, et al. Hypothalamus-pituitary-adrenal modifications consequent to chronic stress exposure in an experimental model of depression in rats[J].Neuroscience，2007，146(4):1734.
       
       [4]Kuipers SD, Trentani A, Westenbroek C, et al. Unique patterns of FOS, phospho-CREB and BrdU immunoreactivity in the female rat brain following chronic stress and citalopram treatment[J].Neuropharmacology，2006，50(4):428.