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       【摘要】 
       目的研究冰片对血小板内游离钙离子浓度(［Ca2+］i)的影响，以探讨其抗血小板聚集作用的可能机制。方法采用双波长Fura-2 荧光法测定血小板胞浆内游离钙离子浓度(［Ca2+］i)。结果在有无细胞外钙存在时，冰片血清均能够明显抑制5-HT诱导的血小板胞内［Ca2+］i升高（P<0.05）。结论冰片可抑制血小板聚集，其作用机制可能与其抑制血小板胞浆［Ca2+］i升高有关。
       【关键词】  冰片； 血小板聚集； 钙； 5-羟色胺
        Effect of Bornel on Cytoplasmic Free Calcium Level in Rat PlateletsYANG Lei，XIU Chun，WANG NingshengInstitute of Clinical Pharmacology of Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangdong Guangzhou 510405，ChinaAbstract：ObjectiveTo investigate the effect of bornel on cytoplasmic free calcium level in rat platelets and its possible mechanism of anti-platelet aggregation.MethodsPlatelet［Ca2+］i was determined by double beam fluorescence spectrophotometric method.ResultsWith or without the presence of extracellular Ca2+， bornel inhibited the increased ［Ca2+］i induced by 5-HT. Conclusion Bornel markedly inhibits the platelet aggregation， and its mechanism may be related to its depression on the rise of platelet ［Ca2+］i．Key words： Ornel；  Platelet aggregation；  Free Calcium；  Serotonin
       
       冰片为龙脑香的树脂和挥发油的加工成品，味辛苦，性微寒，具有开窍醒神，清热止痛的功效。临床上，在许多心脑血管疾病的治疗方剂中均作为主要药物配伍使用，现有文献记载的治疗心血管疾病的复方中，有三十余首含有冰片，其中8首已被2005年版《中国药典》收录。我们前期研究显示，冰片能够抑制模型动物动脉血栓形成，对5-羟色胺诱导的血小板聚集具有抑制作用。因此，本研究采用双波长Fura-2 荧光法测定血小板胞浆游离钙离子浓度(［Ca2+］i)的方法，考察冰片对大鼠血小板胞浆游离钙离子浓度的影响，探讨冰片抑制血小板聚集的作用机制，为冰片的合理应用提供实验依据。
       1  器材
       1.1  动物健康清洁级SD大鼠，雄性，体质量250～300 g，广东省医学实验动物中心提供，合格证号 2005A010。
       1.2  药材及试剂冰片，广州市药材公司中药饮片厂，批号：20040902，经GC-MS测定龙脑含量为56.20％ ，为合成冰片；Fura-2/AM 由日本Dojindo公司提供，用二甲基亚砜（DMSO）溶解成1mmol/L，分装，-20℃避光保存；二甲基亚砜（DMSO）、羟乙基哌嗪乙磺酸（Hepes）均为Amersco公司产品；牛血清白蛋白（BSA），由华美生物工程公司提供；Amresco公司产品；5-羟色胺硫酸肌酐，sigma公司产品，用0.1 mol/L HCl溶液溶解后，用Tris-NaCl溶液调pH为7.4，分装，-70℃避光冻存；乙二醇双（2-氨基乙基）醚四乙酸（EGTA），MBCHEM公司产品，用新鲜配制的1 mol/L NaOH配制成0.5mol/L的溶液（pH8.5）；TritonX-100，Amresco公司产品，用三蒸水配成20％的溶液；ACD溶液含柠檬酸钠89 mmol/L、柠檬酸16 mmol/L、葡萄糖243 mmol/L；无Ca2+的Hepes缓冲液含NaCl 140 mmol/L、KCl 3 mmol/L、MgSO4 1 mmol/L、Hepes 10 mmol/L、葡萄糖10 mmol/L，用1mol/L NaOH调pH7.40； 血小板负载液含NaCl 140 mmol/L、KCl 3 mmol/L、MgSO4 1 mmol/L、Hepes 10 mmol/L、葡萄糖10 mmol/L，0.4%BSA，用1mol/L NaOH调pH7.40，使用前预先通氧饱和；其它均为国产分析纯，所有试剂均用新鲜制备的三蒸水配制。
       1.3  仪器LS-55 荧光分光光度计，美国Perkin-Elmer公司产品。
       2  方法
       2.1  冰片含药血清的制备取雄性SD 大鼠20 只，随机分为冰片组和溶剂对照组，每组10 只。冰片组灌服冰片粟米油溶液（1.5 g·kg-1）15 ml·kg-1，给药1 次，药后30 min，腹主动脉取血，400 r/min离心15 min，分离血清，56 ℃水浴30 min 灭活，得冰片血清，置-70℃冰箱保存备用。溶剂对照组给等容量的粟米油，按上述方法制备空白血清。应用气相色谱法测得冰片血清中含冰片12.16 μg·mL-1。
       2.2  水洗大鼠血小板悬液制备大鼠以10％水合氯醛35mg/kg体质量腹腔注射麻醉，腹主动脉穿刺取血8 ml，用ACD溶液以1∶5（ACD∶血）的比例抗凝，在(20±2)℃下76×g离心15 min，吸取上层富含血小板血浆（PRP），再将PRP在(20±2)℃下以500×g离心5 min，弃上清，得血小板沉淀，用无Ca2+的Hepes缓冲液洗1次，450×g离心5 min，弃上清，用无Ca2+的Hepes缓冲液悬浮。台朌蓝排斥试验检查细胞活性，活细胞率>90%。
       2.3  Fura-2/AM负载取1 ml血小板悬液与1ml血小板负载液，5 μmol/L Fura-2/AM混匀，使得Fura-2/AM在血小板悬液中的终浓度为2.5 μmol/L，37℃水浴避光孵育40 min，立即离心，弃上清，沉淀以无Ca2+ Hepes缓冲液洗两次，再用无Ca2+ Hepes缓冲液重新悬浮，调整血小板浓度为300～400×109个plt/L待测。
       2.4  分组及给药负载后的血小板悬液分为3组，分别是空白血清组、冰片血清低浓度组、冰片血清高浓度组。各组均于测定前用相应的空白血清或冰片含药血清37℃孵育10 min后，进行荧光测定。
       2.5  荧光强度测定［1，2］取负载的血小板悬液37℃温孵5 min，在PE LS-55型荧光分光光度计上做荧光测定，固定发射波长为510 nm，扫激发波长，如激发波长波峰由380 nm移至340 nm，则表明Fura-2/AM已负载酯解进入细胞内。采用FFA模块的改变波长的时间扫描，激发波长分别固定在340 nm、380 nm，波宽5 nm，发射波长固定在510 nm，波宽5nm，记录Fura-2在激发波长340 nm、380 nm处测得的荧光强度比值（F340/F380），然后加入20μl 20％的TritonX-100，测定Rmax，再加入20 μl 0.5 mmol/L的EGTA，测定Rmin，根据比值法公式计算出血小板内［Ca2+］i浓度。
       
       ［Ca2+］i=Kd×R-(Rmin)(Rmax-R)×SFB
       式中Kd为Fura-2/AM与Ca2+反应的解离常数，为224 nmol/L，R为各测定点F340对F380荧光强度的比值。Rmax为加入TritonX-100使得Fura-2和钙离子结合达饱和时所测得的F340/F380，Rmin为加入高于Ca2+浓度2～3倍的EGTA，使得Fura-2游离，测得的F340/F380。SFB为组成Rmin和Rmax的F380之间的比值。实际计算结合FLB软件中ICBC模块代入公式计算。
       2.6  统计方法各组数据以 表示，用SPSS软件包分别进行配对T检验，以P<0.05为有统计学意义。
       3  结果
       3.1  血小板Fura-2/AM的波峰移动特性固定发射波长为510 nm，在300～400 nm之间扫激发光谱，血小板负载后，激发光波峰在340 n   m（如图 1，a），去除负载的血小板上清液的激发光波峰在380 nm（如图1），Fura-2的钙结合态和非结合态荧光光谱移动，表明血小板已被Fura-2/AM负载。
       3.2  冰片对血小板非特异性Ca2+内流的影响由表1可见，血小板分别用不同浓度冰片血清孵育后，血小板胞内静息［Ca2+］i与相应浓度的空白血清比较无显著差异（P>0.05）。在细胞外液加入CaCl2溶液，使其终浓度为1 mmol/L，则各组细胞内游离［Ca2+］i均明显升高（P<0.01）。非特异性内流的［Ca2+］i为加入CaCl2后的胞内［Ca2+］i与静息［Ca2+］i之差，可见冰片组与空白血清组非特异性内流的［Ca2+］i之间无显著差略)
       3.3  冰片对5-HT诱导的Ca2+内流的作用在细胞外液含有1 mmol/L CaCl2的情况下，加入20 μmol/L的5-HT，血小板内［Ca2+］i缓慢升高，最后达到明显高于基础值的平台期。由表2可见，各组血小板胞内［Ca2+］i均明显高于静息血小板［Ca2+］i（P<0.01），说明5-HT能够明显诱导血小板内［Ca2+］i升高。升高的血小板内［Ca2+］i为5-HT引起的胞内质膜释放的钙和5-HT诱导的细胞外液内流的Ca2+，1.2 μg·ml-1冰片血清能够明显抑制5-HT的这一作用，降低5-HT诱导的血小板胞内［Ca2+］i升高（P<0.05）。表2  冰片对血小板Ca2+内流的作用(略)
       3.4  冰片对5-HT诱导的胞内Ca2+释放的影响在无钙的HEPES缓冲液中加入EDTA，使其在血小板外液中的终浓度为0.1 mmol/L，测得各组血小板胞内静息［Ca2+］i，各组间无显著差异。加入20 μmol/L的5-HT后，血小板胞内［Ca2+］i明显升高，并在高于基础值的位置形成平台期。由表3可见，各组血小板内游离钙离子浓度均明显高于静息值（P<0.01），说明5-HT能够明显诱导血小板胞内钙离子释放。加入5-HT测得的血小板内［Ca2+］i与静息［Ca2+］i之差就是由血小板胞内致密颗粒等释放的钙离子，1.2 μg·ml-1冰片血清能够降低血小板释放的［Ca2+］i，与相应浓度的空白血清比较有显著差异（P<0.05）。表3  冰片对血小板Ca2+内流的作用(略)
       4  讨论
        众所周知，Ca2+做为第二信使在血小板活化过程中起到关键性的作用，它是血小板代谢与功能的一个重要调节因子，血小板的变形、聚集、释放反应中都伴有血小板胞浆内游离Ca2+浓度（［Ca2+］i）的升高［3］。5-HT能够浓度依赖地引起血小板胞浆内游离的Ca2+浓度升高［4］，已有研究证实，5-HT诱导的血小板胞内［Ca2+］i升高是一个连续并且相对独立的过程［5］。首先，5-HT刺激血小板胞内储存的Ca2+释放，因此在无细胞外钙存在下5-HT能够引起血小板胞内游离Ca2+浓度的迅速升高，这一作用可以被1 mmll/L EGTA完全阻断。然后，5-HT可以通过激活血小板上的5-HT2受体启动G蛋白耦连信号转导途径，引起血小板胞外Ca2+内流，但是需要很长的滞后时间，这一过程可以补充5-HT诱导的血小板胞内Ca2+储存耗竭。我们的实验也证实了，在细胞外液有无钙离子存在的情况下，5-HT均能引起血小板胞内游离［Ca2+］i升高。
       
       我们的研究结果显示，在1mmol/L细胞外钙存在下，高浓度的冰片血清能够抑制5-HT引起的血小板胞内［Ca2+］i升高，说明冰片能够抑制5-HT引起的外钙内流。同时，在无细胞外钙存在下，高浓度的冰片血清也能抑制5-HT引起的血小板胞内［Ca2+］i升高，说明冰片能够抑制5-HT引起的细胞内钙释放。由此可见，冰片抑制5-HT诱导的血小板内钙释放、外钙内流可能其抑制血小板聚集的作用机制之一。5-HT激活血小板上的5-HT受体，与Gαq蛋白偶联，活化PLC-β，使磷酸肌醇水解生成三磷酸肌醇（IP3）和二酯酰甘油（DAG），从而既可引起血小板胞外Ca2+内流也可诱导血小板胞内贮存的Ca2+释放至胞浆内［6］。冰片对5-HT诱导血小板胞内Ca2+浓度升高的抑制作用，是否与其影响5-HT受体信号转导通路有关，还需进一步证明。
       【参考文献】
         1］丁敏，钟梁. 用Fura-2/AM测定血小板胞浆游离钙浓度［J］. 大学化学，2004，19(4):48.
       
       ［2］尹松梅，陈晓琳，聂大年，等. 氯通道阻断剂对血小板胞浆游离钙和血小板聚集的影响［J］. 中华血液学杂志，2005，26(3):170.
       
       ［3］Sanders D， Pelloux J， Brownlee C， et al. Calcium at the crossroads of signaling［J］. Plant Cell, 2002，14 Suppl:S401.
       
       ［4］Wockel， L.， Koch, S., Stadler, C., et al.， Serotonin-induced platelet intracellular Ca2+ response in patients with anorexia nervosa［J］. Pharmacopsychiatry， 2008，41(1): 10.
       
       ［5］Turetta， L.， Donella-Deana, A., Folda, A., et al. Characterisation of the serotonin efflux induced by cytosolic Ca2+ and Na+ concentration increase in human platelets. Cell Physiol Biochem， 2004，14(4～6):377.
       
       ［6］Turetta， L.，Banzzan, E., Bertagno, K., et al.， Role of Ca2+ and protein kinase C in the serotonin (5-HT) transport in human platelets. Cell Calcium， 2002，31(5): 235.