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       【摘要】 
       目的探讨金匮肾气丸对庆大霉素造成药物性耳聋豚鼠耳蜗螺旋神经节细胞凋亡调控基因表达的影响。方法豚鼠腹腔注射庆大霉素100 mg/(kg·d)制作耳聋动物模型，治疗组在注射庆大霉素后灌服金匮肾气丸水煎剂，实验结束后豚鼠断头处死，取耳蜗标本。观察指标：免疫组化Bax及Bcl-2的表达定量检测分析和电镜组织学观察。结果模型组Bax蛋白表达比正常组、治疗组表达显著增多（P＜0.01)。模型组、治疗组Bcl-2蛋白表达均明显减少（P＜0.01），治疗组Bcl-2蛋白表达高于模型组（P＜0.01）。 结论金匮肾气丸可通过抑制Bax蛋白表达，调节Bcl-2蛋白表达而达到对耳蜗螺旋神经节细胞凋亡的调控作用。
       【关键词】  金匮肾气丸； 细胞凋亡
        Effects of Bushen Pill on Apoptosis Genes of Spiral Ganglion Cells Guinea Pigs with OtotoxityWANG Feng, ZHAO WulanZhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, China　Abstract:ObjectiveTo explore the protective effects of  Jingui Shenqi Pill on apoptosis genes of spiral ganglion cells in guinea pigs with ototoxity by gentamycin; MethodsThe ototoxity model was induced by abdominal injection of 100 mg/(kg·d) gentamycin，while the treatment group took Jinguishenqi pill after injection of gentamycin, executed after the experiment, and the cochleas were gathered for detection. The observation indexes were as follows: the quantitative testing examination analysis and electro-microscopic observation of immunohistochemical Bax and Bcl-2.ResultsCompared with other groups, model group had much higher expression of Bax（P＜0.01); the expression of Bcl-2 was obviously reduced both in treatment group and model group（P＜0.01）, especially in model group（P＜0.01）.ConclusionJingui Shenqi Pill has effects on spiral ganglion cells apoptosis by controling the expression of Bax and regulating the expression of Bcl-2.
       Key words:Jingguishenqi pill；  Apoptosis
        中医认为肾与耳关系密切，表现在生理上互相联系，病理上亦互相影响。因此中医药在防治耳聋方面常采取补肾的方法［1］。金匮肾气丸为传统的补肾方剂，已有学者［2］对其防治神经性耳聋进行了相关的实验研究，但国内尚未见其对耳蜗细胞凋亡基因调控的报道。本研究拟从此着手，探讨其防治耳聋的相关机理。
       1  器材
       1.1  动物健康、无耳疾、耳廓反应灵敏的白色红目雌雄性豚鼠30只，体质量230～260 g，购自浙江中医药大学动物实验中心，标准饲养于浙江中医药大学动物实验中心。
       1.2  试剂及药品
       免疫组化检测试剂盒EnVisionTM Two-Step Histostaining Reagent Lot: 00037018为丹麦DAKO公司的产品；Bax和Bcl-2抗体：美国LabVision-NeoMarkers公司产品，批号: H42020030。庆大霉素0.5 g/2 ml, 天津药业焦作有限公司。金匮肾气丸水煎剂，据文献记载［3］，按《金匮要略》的组成(干地黄、山药、山茱萸、泽泻、牡丹皮、茯苓、桂枝、炮附子)与剂量，本校制剂室制成水煎剂，生药含量1.0 g／ml。
       1.3  仪器
       石蜡切片机MICROW HM34OE型，德国；荧光显微镜摄像机：OLYMPUS BX60型，日本；BMJ -III型包埋机及冷冻台，中国江苏； HPIAS-1000病理图文分析系统，中国武汉同济千屏影像工程公司。
       2  方法
       2.1  动物分组30只豚鼠随机分为3组，分别为正常对照组（正常组）、金匮肾气丸组（治疗组）和肾虚耳聋模型对照组（模型组）。每组各10只。标记动物后于安静环境下饲养。
       2.2  造模及标本将模型组豚鼠按100 mg/(kg·d)注射庆大霉素，治疗组豚鼠每天注射庆大霉素（剂量同模型组）后立即灌服金匮肾气丸水煎剂，给药量为13.5 g/（kg·d）(相当于成人公斤体重用药量的10倍)，正常对照组2.5 ml/（kg·d）剂量腹腔注射生理盐水后不做其它处理，3组在同样的环境下饲养10 d。10 d后，所有豚鼠断头处死，取耳蜗制备标本。
       2.3  免疫组化定量分析Bax及Bcl-2的表达石蜡切片脱蜡水化后，采用高温高压修复；滴加适当比例稀释的一抗，用PBS代替一抗为空白对照；PBS冲洗；滴加山羊抗小鼠IgG抗体-HRP多聚体，37℃孵育；PBS冲洗；DAB显色液显色，显微镜下控制反应，自来水冲洗终止反应；复染细胞核，乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。利用HPIAS-1000病理图文分析系统采集图象，定量分析Bax及Bcl-2的表达情况。采集视野200倍测量，然后进行整理及统计分析。
       2.4  统计方法实验数据以 ±s表示；采用统计软件包SPSS11.5对各组数据进行统计分析，多组间均数比较用方差分析。均以P<0.05和P<0.01为差异显著标准。
       3  结果
       3.1  金匮肾气丸对庆大霉素耳损伤豚鼠耳蜗螺旋神经节细胞Bax表达变化的影响见表1。从表1可以看出，模型组Bax蛋白表达增多，与正常组比较，差异显著（P＜0. 01)；治疗组与模型组比较，有显著性差异（P＜0.01)。表1  各组豚鼠耳蜗螺旋神经节细胞Bax
       表达的积分光密度值(IOD)（ 略）
       3.2  金匮肾气丸对庆大霉素耳损伤豚鼠耳蜗螺旋神经节细胞Bcl-2表达变化的影响见表2。表2结果显示，正常组有一定数量的Bcl-2蛋白表达。模型组、治疗组Bcl-2蛋白表达均明显减少，与正常组比较均有显著统计学差异（P＜0.01）。治疗组也有减少，但与模型组比较升高，有明显统计学差异（P＜0.01）。表2  各组豚鼠耳蜗螺旋神经节细胞Bcl-2表达的积分光密度值(IOD)（略）
       3.3  电镜下的效果图的分析见图1～6（200×）。
       棕黄色为阳性反应细胞，蓝色为阴性反应细胞。Bax在模型组表达增高，治疗组都有不同程度的表达，但表达低于模型组（见图1～3）；Bcl-2在模型组少量表达或无表达；治疗组表达高于模型组（见图4～6）。
       4  讨论
        本研究中耳蜗螺旋神经节细胞(SGC)位于蜗轴与骨螺旋板相连处的螺旋神经节，是双极感觉神经元，可接受神经递质(如毛细胞释放的谷氨酸盐)的刺激而兴奋，将毛细胞的信号传向听觉中枢［4］。耳蜗螺旋神经节细胞是听神经传入初级神经元，与听觉信息的传输过程密切相关。SGC作为听觉传入的初级神经元，它的损伤程度直接反映了听力的受损程度。维持一定数量健康、正常的SGC对于听功能的维持是十分必要的［5］。耳毒性药物、强噪声、缺氧等多种类型的损伤因素均可诱导内耳组织(包括SGC)出现凋亡［6］。因此本研究中选取了耳蜗螺旋神经节部位，观察该部位细胞凋亡调控基因的表达。
        Bcl-2是一种广义的抗凋亡基因，它通过对细胞凋亡的调控延长细胞寿命，称为细胞凋亡抑制基因，可在细胞周期的任一阶段抑制细胞凋亡。Bax基因为Bcl-2家族成员，是一种可溶性蛋白，Bax表达具有对抗Bcl-2蛋白抑制凋亡的作用［7］。因此Bcl-2过度表达可以抑制细胞凋亡的发生，Bax的过度表达可抵抗Bcl-2的抑制凋亡的作用，因此是促进细胞凋亡的基因。李明栋［8］在其对庆大霉素作用下豚鼠耳蜗螺旋神经节细胞Bcl-2及Bax的表达的研究中发现，庆大霉素作用下，Bcl-2和Bax表达发生变化，Bcl-2蛋白家族参与了庆大霉素诱导的耳蜗螺旋神经节细胞凋亡。从本研究的结果也可以看出，在应用庆大霉素后，模型组豚鼠耳蜗螺旋神经节细胞凋亡Bcl-2和Bax表达相对于正常组发生了明显的变化，表现在Bax表达的增高和Bcl-2表达的降低，由此可以推断庆大霉素可以通过诱导Bax和Bcl-2表达引起细胞凋亡。
        金匮肾气丸源自中医经典书籍，医圣张仲景所著《金匮要略》，为中医传统的补肾方药。从本研究Bax及Bcl-2免疫组化结果结合电镜图显示，治疗组Bcl-2有一定表达且高于模型组，却没有正常组表达高。治疗组Bax表达，低于模型组，却高于正常组。所以我们分析，庆大霉素导致豚鼠耳蜗损伤后，能上调Bax蛋白表达，抑制Bcl-2的表达，从而导致耳蜗螺旋神经节毛细胞凋亡。而应用金匮肾气丸进行治疗后，拮抗了庆大霉素损伤的诱导细胞调亡的机制，从而起到了防治耳聋的效果。
       【参考文献】
         1］宣伟军，余养居.感音神经性聋中医中药研究进展［J］.中国中西医结合耳鼻咽喉科杂志，2003，11（5）：256.
       
       ［2］王东方，干祖望，苏长青，等.金匮肾气丸对庆大霉素肾和耳损害保护作用组织病理学研究［J］.南京中医药大学学报,1998,14(5）：278.
       
       ［3］郑东升，郑小伟.金匮肾气丸对肾阳虚大鼠 17α-羟化酶基因表达的影响［J］.中国中医药信息杂志，2006，13（10）：42.
       
       ［4］杨威，王轶，宋鄂，等.耳蜗螺旋神经节细胞的电生理实验研究现状［J］.国外医学·耳鼻咽喉科学分册，2004，28（6）：326.
       
       ［5］薛秋红，陈佳，龚树生，等.强噪声暴露下豚鼠耳蜗螺旋神经节细胞凋亡及Caspase-3的表达［J］.听力学及言语疾病杂志， 2007，15（3）：208.
       
       ［6］Alam SA，Ikdea　K，Oshima T，et a1．Cisplatin- inducde apoptotic cell　death in mongolina gerbil ccohlea［J］.Hear Res，2000，141：28．
       
       ［7］Hoetelmans R, van Slooten HJ, Keijzer R, et al. Bcl-2 and bax proteins are present in interphase nuclei of mammalian cells［J］.Cell Death Differ.2000, 7(4):384.
       
       ［8］李明栋,刘兆华.庆大霉素作用下豚鼠耳蜗螺旋神经节细胞bcl-2及Bax的表达［J］.重庆医学，2006，35（5）：405.