文章标题 全文   多个检索词，请用空格间隔。

       【摘要】 
       目的考察大孔吸附树脂对迷迭香酸的吸附性能和纯化效果，寻找从迷迭香中分离纯化迷迭香酸的较优工艺。方法以迷迭香酸的吸附量、解吸率和所得粉末中迷迭香酸的含量为指标，从4种大孔吸附树脂中筛选出较好的D101树脂。通过静态和动态实验，对迷迭香酸在D101树脂上吸附和解吸的条件进行考察和优化。结果采用D101树脂从迷迭香中分离纯化迷迭香酸的较优工艺参数为：上柱液pH 3～4，速度2 BV/h，溶液处理量9 BV，洗脱剂为40%乙醇，洗脱速度1 BV/h，收集洗脱液3 BV。按此工艺条件，迷迭香酸的解吸率为94.8%，3 BV洗脱液浓缩干燥后，所得粉末中迷迭香酸含量为23.7%，树脂经8次重复使用，吸附量和分离效果无明显下降，可以重复使用。结论 D101树脂可从迷迭香中较好的分离纯化迷迭香酸，具有潜在的工业应用价值。
       【关键词】  迷迭香酸； 大孔吸附树脂； 迷迭香； 分离； 纯化
        Separation of Rosmarinic Acid from Rosmarinus Officinalis L. with Macroporous Absorption ResinYUAN Ganjun, LONG Lina1.Agricultural College，Hainan University，Haikou 570228，China； 2.Pharmacyological Department, Hainan Medical College，Haikou 571101，China； 3.Hainan College of Vocation and Techniology，Haikou 570216，ChinaAbstract:ObjectiveTo evaluate the absorption capability and purification effect of rosmarinic acid on macroporous absorption resin, and to find a better method to separate and purify rosmarinic acid from Rosmarinus officinalis L.. MethodsMacroporous resin D101 was more suitable for the separation and purification of rosmarinic acid among four kinds of resins selected with absorption capacity, desorption ratio and the content of rosmarinic acid in the powder obtained as criteria．Optimal conditions for absorption and elution of rosmarinic acid were performed with static and dynamic experiments.ResultsThe result showed that the optimum technology parameters were as follows：the pH value of solution 3 to 4, flow rate 2 BV/h, solution treatment capacity 9 BV, and rosmarinic acid absorbed can be desorbed by 40% alcohol at flow rate 1 BV/h, and collected 3 BV eluent. The desorption ratio of rosmarinic acid was 94.8% according to the absorption and desorption conditions above, and the content of rosmarinic acid in powder obtained from 3 BV eluent through concentration and dry was 23.7%. After eight times of repeated use, the absorption capability and separation effect of the macroporous resin was not decreased obviously, and the macroporous resin could be recycled.ConclusionRosmarinic acid in Rosmarinus officinalis L. can be effectively separated and purified with the macroporous absorption resin D101, and has the potential application value in industry.
       Key words:Rosmarinic acid；Macroporous absorption resin；  Rosmarinus officinalis L.；  Separation；  Purification
       
       迷迭香Rosmarinus officinalis L.系唇形科迷迭香属植物，为多年生常绿小灌木，原产于地中海地区，国内近年来大面积的引种栽培。该植物具有抗氧化、抗病毒和抗肿瘤等活性，广泛应用于医药、食品和饮料等行业。研究发现［1～4］：该植物所含的水溶性酚酸成分—迷迭香酸（Rosmarinic acid）具有明显的抗氧化、抗炎、免疫抑制、抗血栓、抗菌、抗病毒等生物活性。
       
       迷迭香酸不仅迷迭香植物含有，也存在于其他唇形科植物如紫苏、丹参，但近年来国外市场对从迷迭香中提取的不同含量的迷迭香酸粗品比从其他植物中提取更为关注。关于从迷迭香中提取迷迭香酸的研究有文献报道［5］，但未见提取后纯化工艺的研究，更未见采用大孔吸附树脂分离纯化迷迭香中迷迭香酸的报道。
       
       近年来，随着大孔吸附树脂在天然产物活性成分分离方面应用的日益广泛［6，7］，其优良的分离纯化效果，可反复再生使用和低成本的应用特点，非常适合于大生产的要求。为此，本文采用大孔吸附树脂法，对迷迭香中迷迭香酸的分离纯化工艺进行研究。现报道如下。
       1   仪器与材料
       1.1  仪器LC-10AVP高效液相色谱仪，日本岛津公司产品；METTLER TOLEDO AL204 电子天平，瑞士梅特勒公司产品；R-205B旋转蒸发仪，上海申胜生物技术有限公司产品；PHB-5型笔试pH计，上海康仪仪器有限公司产品。
       1.2  试剂大孔吸附树脂：D101，天津农药股份有限公司产品；AB-8，南开大学化工厂产品；XAD-2，美国罗门哈斯公司产品；HP-20，日本三菱化学公司产品；迷迭香酸对照品，天津尖峰天然产物公司产品；甲醇为色谱纯，美国Dima公司产品；其他试剂均为分析纯，广州化学试剂厂产品。
       1.3  药品迷迭香粉末：迷迭香由海南舒普生物科技有限公司提供，经该公司鉴定为唇形科植物迷迭香Rosmarinus officinalis L.的干燥地上部分，粉碎成粗粉，备用。
       2  方法与结果
       2.1  迷迭香酸的含量测定［8］
       2.1.1  色谱条件色谱柱：Shim-pack VP-ODS(4.6 mm×150 mm，4.6 μm)，流动相：甲醇－0.1％甲酸溶液(45∶55，V/V)，柱温：30℃，检测波长：330 nm，流速：0.8 ml/min。
       2.1.2  迷迭香酸标准曲线的测定精密称取迷迭香酸20.0 mg，置25 ml容量瓶中，用稀乙醇溶解后，定容，混匀，得0.8 mg/ml对照品溶液。再精密量取1.0 ml该对照品溶液，置100 ml的容量瓶中，用稀乙醇定容，得0.008 mg/ml的迷迭香酸对照品溶液。分别吸取0.8 mg/ml迷迭香酸对照品溶液5，10，20 μl以及0.008 mg/ml迷迭香酸对照品溶液5，10，20 μl，按上述色谱条件分别进样测定，记录迷迭香酸对应的色谱峰面积。以进样量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），线性回归得回归方程：Y=3 455 806.475X + 218 212.581 8，r=0.999 6。表明迷迭香酸在0.04～16.0 μg范围内进样量与色谱峰面积具有良好的线性关系。
       2.1.3  样品溶液的制备及测定称定迷迭香水提物200.0 mg或迷迭香提取物（已经树脂纯化）20.0 mg，置100 ml容量瓶中，加稀乙醇约50 ml，超声10 min，冷却后用稀乙醇定容，混匀，0.45 μm滤膜过滤，弃去初滤液，取续滤液作为样品溶液。树脂静态和动态实验中的溶液样品，根据样品中迷迭香酸可能的含量，直接混匀或加入一定量的稀乙醇稀释混匀，0.45 μm滤膜过滤，弃去初滤液，取续滤液作为样品溶液。取上述各种样品溶液适量，进样20 μl，采用外标法测定迷迭香酸的含量。
       2.2  吸附原液的制备称取迷迭香粉约20 kg，依次加入160，120 L纯水，90～95℃提取2次，过滤，合并两次提取液，减压浓缩，喷雾干燥，混匀，得迷迭香水提物3.5 kg，经测定，迷迭香酸的含量为2.72%（干计），冷藏备用。临用前，取上述迷迭香水提物适量，加纯水，根据需要制成至固体含量1%～10%（质量体积百分数）的水溶液，作为吸附原液。
       2.3  吸附树脂的预处理树脂先用乙醇浸泡溶胀24 h，湿法装柱，用95％乙醇洗脱，至流出液加5倍量的纯水不变白色浑浊为止。再用大量的纯水洗尽柱内乙醇，然后依次用3倍树脂体积的5%盐酸、纯水、4％氢氧化钠浸泡、流过树脂柱，最后用大量纯水洗至流出的水近中性，作为湿树脂，备用。
       2.4  吸附量和解吸率的计算试验中的吸附量、吸附率和解析率的计算公式如下：
       
       Q（mg/ml湿树脂）=（C0V0－CeVe）/V式①
        A（%）=（C0V0－CeVe）/C0V0×100%式②
        D（%）=CDVD/（C0V0－CeVe）式③
        式①、②、③中：Q为吸附量；A为吸附率；D为解吸率；C0为吸附原液中迷迭香酸的浓度；V0为吸附原液体积；Ce为迷迭香酸的平衡浓度（静态实验），或上柱和水洗时流出液合并后溶液中迷迭香酸的浓度（动态实验）；CD为解吸液中迷迭香酸的浓度；Ve为吸附原液体积（静态实验，等于V0），或上柱和水洗时流出液合并混匀后的体积（动态实验）；V为湿树脂体积；VD为解吸液体积。
       2.5  吸附树脂的筛选准确量取经预处理的4种湿树脂各300 ml，分别装入直径为40 mm的玻璃柱，各上样2 000 ml 8%吸附原液，速度6.0～6.5 ml/min，然后用600 ml纯水以相同的速度洗脱，上样和水洗时流出液合并，分别混匀，测定其迷迭香酸的浓度，计算4种树脂对迷迭香酸的吸附量。然后分别依次用750 ml 70%乙醇（V/V）洗脱，洗脱速度6.0～6.5 ml/min，得70%乙醇洗脱液，混匀，测定其迷迭香酸的浓度，计算4种树脂的解吸率。将70%洗脱液浓缩，冻干，得固体粉末，测定迷迭香酸的含量。筛选实验的结果见表1。表1  不同树脂对迷迭香酸的吸附和解吸效果（略）
       由表1可知， D101树脂虽在吸附量和解吸率上和XAD-2、HP-202种树脂没有明显差别，但其洗脱液浓缩、干燥所得粉末中迷迭香酸的含量明显大于其余树脂，故选用D101树脂对迷迭香酸的分离纯化工艺进行研究。
       2.6  静态实验
       2.6.1  吸附的动力学过程准确量取10.0 ml经预处理的D101湿树脂，置250 ml三角瓶中，环境温度30℃左右，加入100 ml 8%吸附原液，分别在设定的时间点取样，测定D101树脂静态吸附的动力学过程。（见图1）。由图1可知，开始40 min内，树脂对迷迭香酸的吸附很快，随后变慢，而在60～90 min之间又突然变快，150 min后吸附增加缓慢，300 min以后吸附基本达到动态平衡。
       2.6.2  温度对吸附性能的影响准确量取10.0 ml经预处理的D101湿树脂，置250 ml三角瓶中，加入100 ml 8%吸附原液，共6份，分别置于10，20，30，40，50，60℃的环境下，静态吸附24 h。以吸附率作为吸附性能的评价指标，考察温度对D101树脂吸附性能的影响。结果表明，10～40℃之间D101树脂的吸附性能较稳定，当温度超过50℃时，吸附率明显下降。故在正常的工作环境下，温度对树脂吸附迷迭香酸的性能无明显影响。
       2.6.3  pH值对吸附性能的影响准确量取10.0 ml 经预处理的D101树脂，加入到250 ml的三角瓶中，共6份，分别加入100 ml pH值为3，4，5，6，7，8的8%吸附原液（用1 mol/L的盐酸或氨水调节），静态吸附24 h。考察吸附原液pH值对D101树脂吸附性能的影响。结果见表2。
       
       由表2可知，吸附原液的pH 3～4时吸附量较大，随着pH值的增加，迷迭香酸的吸附量减少，尤其是pH大于6.0后，所以吸附原液宜调pH 3～4。
       2.6.4  不同乙醇浓度的静态解吸效果准确量取10.0 ml在8%吸附原液中饱和吸附的D101树脂，加入到250 ml的三角瓶中，共6份，分别加入20%，30%，40%，50%，60%，70%（V/V）不同浓度的乙醇静态解吸24 h，以考察迷迭香酸解吸的较佳乙醇浓度，结果见表3。表2  不同pH值条件下的吸附量（略）表3  不同乙醇浓度的解析效果（略）
       由表3可知，50%以上的乙醇浓度即可将迷迭香酸完全解吸，40%乙醇的解吸率为93.2%，略小于50%乙醇的解吸率，但解吸时洗脱物中迷迭香酸的含量也是要考虑的重要因素。故最佳乙醇解吸浓度有待动态实验的进一步考察。
       2.7  动态实验
       2.7.1  不同上样速度对树脂动态吸附性能的影响将500 ml经预处理的D101湿树脂湿法装柱（Ф40 mm×700 mm），环境温度30℃下，用配制的8%迷迭香水提液（用1 mol/L氨水调节pH3～4）作为吸附原液上柱，在相同的实验条件下，加液量分别为3,6，9，12，15，18 BV，分别以1，2，3，4 BV/h的流速在同一试验条件下进行动态吸附性能的考察，结果见图2。由图2可知，上样量最大为9 BV，而此时上样速度超过2 BV/h时即有泄漏。故以2 BV/h的速度上样9 BV的8%吸附原液较好。
       2.7.2  树脂动态解吸曲线的考察取500 ml经预处理的D101湿树脂湿法装柱（Ф40 mm×700 mm），环境温度30℃下，以2 BV/h的速度上样4 500 ml吸附原液（pH 3～4），然后用大量的纯水冲洗至基本无色，分别用40%乙醇、50%乙醇洗脱，洗脱速度1 BV/h，洗脱液流出125 ml时，开始收集洗脱液，每份125 ml，分别测定每份洗脱液中迷迭香酸的浓度，据此绘制洗脱曲线，结果见图3。从图3可知，用40%乙醇和50%乙醇洗脱，解吸峰均集中、较高。按接收1 500ml的洗脱液计算，40%乙醇、50%乙醇洗脱的解吸率分别为94.8%，98.7%。将合并后的1 500 ml 40%乙醇洗脱液和1 500 ml 50%乙醇洗脱液，分别浓缩、冻干，得淡黄色粉末，测定粉末中迷迭香酸的含量，分别为23.7%，15.9%。结合“2.6.4”项的实验结果，优先选用40%乙醇进行解吸。
       3  讨论与结论
        随着pH值的增加，迷迭香酸的吸附量减少，尤其是pH大于6.0后，说明吸附原液的pH对树脂的吸附性能影响很大，这可能与迷迭香酸含有羧基有关，由于随着pH值的增加，迷迭香酸解离的程度增加，解离程度越大，水溶性和极性越大，而D101为非极性吸附树脂，故吸附性能降低。由于pH过小有引起迷迭香酸消旋和聚合的可能，故在考察pH对吸附性能的影响时，未考察pH小于3的情况。
       选用40%乙醇解吸迷迭香酸，往往不能解吸迷迭香水提液中极性较小的成分，这些成分如果不解吸，树脂的性能会很快下降，故为了保持D101树脂良好的吸附和分离效果，每次用40%乙醇解吸后，都要再用3 BV的90%乙醇解吸吸附在树脂上的极性较小的成分，再用大量的纯水洗柱，方可重新上样。经预处理的D101树脂，按上述上样、解析、再生的工艺，测定8次重复使用中每次树脂的吸附量和解吸率，表明树脂的吸附性能和分离效果无明显下降，可以循环使用。
       
       D101树脂可从迷迭香中较好的分离纯化迷迭香酸，具有潜在的工业应用价值。其较优的工艺路线为：迷迭香经水提后，浓缩，调节pH 3～4，上D101大孔吸附树脂吸附，上样量9 BV（8％固体含量的原吸附液，迷迭香酸2.176 mg/ml），上样速度2 BV/h，水洗至基本无色后后，用40%乙醇洗脱，解吸速度1 BV/h，收集洗脱液3 BV，解吸率94.8%，洗脱液浓缩、冷冻干燥，得淡黄色粉末，迷迭香酸的含量为23.7%，产品淡黄色，水溶性好，可满足市场对迷迭香酸含量的要求。
       【参考文献】
         1］陈立亚．迷迭香酸的研究概况［J］.中国药事，2007，21（11）：923．
       
       ［2］吴建章，郁建平，赵东亮．迷迭香酸的研究进展［J］.天然产物研究与开发，2005，17（3）：383．
       
       ［3］Swarup V, Ghosh J, Ghosh S, et al. Antiviral and anti-inflammatory effects of rosmarinic acid in an experimental murine model of Japanese encephalitis［J］.Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2007, 51(9)：3367．
       
       ［4］Scheckel KA, Degner SC, Romagnolo DF．Rosmarinic acid antagonizes activator protein-1-dependent activation of cyclooxygenase-2 expression in human cancer and nonmalignant cell lines［J］.The Journal of Nutrition, 2008, 138(11)：2098．
       
       ［5］凌敏，瞿婷，李利明．超声波微波辅助萃取法提取迷迭香酸的工艺研究［J］.食品工业科技，2008，4：194．
       
       ［6］马盼香，金华，李雅玲．大孔吸附树脂在天然药物有效成分提取分离中的应用进展［J］.中国现代药物应用，2008，2（6）：101．
       
       ［7］耿艳辉，周站云，郭月玲，等．大孔吸附树脂在天然药物研究中的应用［J］.河北化工，2008，31（5）：18．
       
       ［8］吴良， 袁干军，苏秋玲．高效液相色谱法测定迷迭香中迷迭香酸的含量［J］.海南医学院学报，2006，12（2）：112.