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       【摘要】 
       目的建立甲肿消制剂及灌胃给予甲肿消后大鼠血清中的哈巴俄苷含量测定方法。方法采用RP-HPLC法测定哈巴俄苷的含量，色谱柱：Kromasil C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）和Easyguard保护柱，以乙腈和1％醋酸溶液为流动相，采用梯度洗脱；流速：1 ml· min-1；检测波长为278 nm；进样量：5 μl。结果哈巴俄苷在1.46～146 μg·ml-1的浓度范围内线性良好；低、中、高浓度哈巴俄苷的精密度（RSD）(n=5)分别为1.05%，0.59%，0.80%；日间差（RSD）（n=5）为1.00%；制剂和大鼠血清中哈巴俄苷的加样回收率（n=5）分别为（98.02±1.01）%和（101.03±1.64）%；测定其重现性（RSD）（n=6）分别为0.73%和0.96%；每克制剂中含哈巴俄苷的量为230.5 μg，每毫升含药血清中哈巴俄苷的量为1.88 μg。结论该方法简便、快速、准确、重现性良好，可用于制剂和血清中哈巴俄苷的含量测定。
       【关键词】  哈巴俄苷； 甲肿消制剂； 固相萃取； 反相高效液相色谱
        Determination of Harpagoside in Jia Zhong Xiao Preparation and Rat SerumZHANG Qiuyan, CUI Hanming*, LIU Ximing, ZHU Xiaoyun, BAI GeGuang’anmen Hospital, China Academy of Chinese Medical Science, Beijing 100053 ChinaAbstract：ObjectiveTo develop a determination method of Harpagoside in Jia Zhong Xiao preparation and blood serum of rat. Methods  The RP-HPLC method was applied as with: Kromasil C18 column（250 mm×4.6 mm，5 μm） and Easyguard column. The mobile phase was acetonitrile and 1% acetic acid with linearity gradient elution, the flow rate at 1 ml·min-1, and detection wavelength was 278nm. ResultsAn excellent linearity was obtained over the range of 1.46～146 μg·ml-1. The RSDs of accuracy for 7.3, 29.2, 146μg·ml-1 were 1.05%,0.59%,0.80%, respectively (n=5). The RSDs of intra-day validation were 1.00%. The mean recovery rates of Harpagoside in preparation and serum were (98.02±1.01)%, (101.03±1.64)%,respectively. The RSDs of the determination method for preparation and serum repeatability were 0.73% and 0.96%, respectively. The content of Harpagoside in preparation and serum was 230.5μg·g-1 and 1.88μg·ml-1, respectively.ConclusionThe method is simple, rapid, reliable and repeatable. It’s quite suitable for the analysis of Harpagoside in Jia Zhong Xiao preparation and of rat serum.
       Key words：Harpagoside;  Jia Zhong Xiao preparation;  SPE;  RP-HPLC
        甲肿消处方由玄参、夏枯草等组成，按适当工艺制备成浓度为3g·ml-1饮片的浸膏剂。动物和临床试验证明本制剂具有较好的化痰散结、治疗甲亢型甲状腺肿大的作用。处方中玄参具有凉血滋阴、泻火解毒的功效，用于热病伤阴、津伤便秘、目赤、咽痛等症［1］，其含量较高的特征性成分为哈巴俄苷，有抗慢性炎症、降压、镇痛、解痉、抗乙型肝炎病毒和免疫促进等作用［2，3］。因此，我们采用反相高效液相色谱法建立了浸膏和大鼠血清中的哈巴俄苷的含量测定方法，为进一步阐明本方治疗甲亢的机理和控制制剂质量提供分析方法。
       1  仪器与材料
       1.1  仪器Knaver 液相色谱仪、Knaver UV Detecter（德国Knaver公司）；Kromasil C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；Easyguard保护柱（迪马公司）；ME215P型电子天平；WH-90A微型旋涡混合机；TGL-16C台式高速离心机；B600B型医用低速离心机；固相萃取小柱（C18，200 mg，60 μm，3 ml，瓦里安公司）。
       1.2  药品和试剂哈巴俄苷对照品（批号为200501）购自中国药检所；药材购自同仁堂药店；乙腈为色谱纯，冰醋酸为分析纯，水为高纯水。
       2  方法与结果
       2.1  色谱条件色谱柱为Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈和1％醋酸溶液为流动相，采用梯度洗脱，比例见表1；流速：1 ml· min-1；检测波长为278nm；进样量：5 μl。色谱图结果见图1。表1  乙腈：1％冰醋酸流动相梯度表（略）
       2.2  甲肿消制剂和大鼠含药血清的制备甲肿消制剂的制备：将玄参、夏枯草等饮片按适当的比例配制，加水煎煮提取，提取液过滤，浓缩得浓度为生药3 g·ml-1的浸膏剂。大鼠含药血清的制备：选取体质量（330±20）g的雄性Wistar大鼠30只，其中20只按生药15 g·kg-1的剂量灌胃给予甲肿消浸膏剂，10只按体质量给予同容积生理盐水，2次/d，连续7 d，末次灌胃后1 h，用玻璃毛细管自乙醚麻醉大鼠眼底采血，收集血样于离心管中，放置2 h促凝，1 500 r·min-1离心10 min，吸取上清液，0.22 μm滤膜过滤，滤液即为含药血清和空白血清，-20℃冷冻保存。
       2.3  甲肿消样品的前处理方法精密称取甲肿消浸膏约2 g，用30％甲醇（25，20，20 ml）超声提取3次，提取时间分别为30，20，20 min，提取液离心10 min，转速为3 500 r·min-1，3次上清液合并，浓缩至微干，再用30％甲醇溶解并定容至25 ml，0.45 μm滤膜过滤，滤液按“2.1色谱条件”项进行含量测定。
       2.4  含药血清中哈巴俄苷的前处理方法将C18SPE柱先用2 ml甲醇冲洗，再用2 ml水冲洗活化待用；精密移取解冻后的含药血清2 ml，上样于处理好的SPE柱中，先用4 ml水冲洗，再用2 ml甲醇洗脱，洗脱液过滤，滤液按“2.1色谱条件”项进行含量测定。
       2.5  标准曲线的测定取适量哈巴俄苷对照品，置于样品瓶中，在五氧化二磷干燥器中干燥12 h后，精密称定3.65 mg，用30％甲醇配制成浓度为146 μg·ml-1的标液，然后用30％甲醇稀释成浓度分别为2.92，7.3，14.6，29.2，73 μg·ml-1的标液，按“2.1色谱条件”项测定，以浓度C为横坐标，以峰面积A为纵坐标进行回归，得到标准曲线方程：A=0.218 1 C＋0.096 2， r2=1，哈巴俄苷在2.92～146 μg·ml-1范围内线性关系良好。
       
       取浓度为146 μg·ml-1的哈巴俄苷标液适量，用空白血清分别稀释到200 μl，涡漩混匀，使其浓度依次为1.46，3.65，7.3，14.6，29.2，73 μg·ml-1，离心，上清液按“2.1色谱条件”项测定，以浓度C为横坐标，以峰面积A为纵坐标进行回归，得到标准曲线方程：A=0.186 3C＋0.051 5，r2=0.999 4,血清样品中哈巴俄苷在1.46～73 μg·ml-1范围内线性关系良好。
       2.6  精密度和稳定性的测定选浓度为7.3，29.2，146 μg·ml-1的哈巴俄苷对照溶液，分别连续进样5次，按“2.1色谱条件”项测定，记录色谱图，将峰面积代入线性方程中，求出计算浓度，并计算相对标准偏差（RSD）。结果见表2。表2  哈巴俄苷标液的精密度和回收率（略）
       选浓度为29.2 μg·ml-1的哈巴俄苷对照溶液，连续5 d进样，按“2.1色谱条件”项测定，记录色谱图，计算其日间差（RSD）为1.00%。
        选浓度为3.65，14.6，73 μg·ml-1的哈巴俄苷血清对照溶液，分别连续进样5次，按“2.1色谱条件”项测定，记录色谱图，将峰面积代入线性方程中，求出计算浓度，并计算相对标准偏差（RSD）,结果见表3。表3  哈巴俄苷血清标液的精密度和回收率（略）
       
       选浓度为14.6 μg·ml-1的哈巴俄苷血清对照溶液，连续5天进样，按“2.1色谱条件”项测定，记录色谱图，计算其日间差（RSD）为0.63%（n=5）。
       2.7  加样回收率的测定精密称取已知含量的甲肿消制剂5份，再精密加入已知浓度的哈巴俄苷对照溶液，分别按“2.3”项和“2.1”项操作，测定其含量，将峰面积代入线性方程计算哈巴俄苷的浓度，计算平均回收率为（98.02±1.01）%，并求精密度RSD为1.03%。
       
       精密量取空白血清5份，再精密加入已知浓度的哈巴俄苷对照溶液，分别按“2.4”项和“2.1”项操作，测定其含量，将峰面积代入线性方程计算浓度，计算平均回收率为（101.03±1.64）%，并求精密度RSD为1.63%。
       2.8  重复性实验精密称定甲肿消浸膏6份，称量量分别为2.047 2，2.028 8，2.043 1，2.027 4，2.057 0，2.044 g，按照“2.3”项中供试品溶液的制备方法制备6份样品，分别取5 μl进样，按“2.1色谱条件”项测定，记录色谱图。根据峰面积计算哈巴俄苷的含量，并求得6次测定的RSD为0.73%。
       
       精密移取含药血清2 ml，按“2.4”项中含药血清供试液的制备方法制备6份样品，分别取5 μl进样，按“2.1色谱条件”项测定，记录色谱图。根据峰面积计算哈巴俄苷的含量，并求得6次测定的RSD为0.96%。
       2.9  甲肿消制剂和大鼠血清中哈巴俄苷的测定精密称定甲肿消浸膏2.037 5 g，按“2.3”和“2.1”项操作，记录色谱图，根据峰面积和线性方程计算，每克制剂中含哈巴俄苷的量为230.5 μg；精密移取含药血清2 ml,按“2.4”和“2.1”项操作，记录含药血清中哈巴俄苷的峰面积，根据峰面积和其线性方程计算，每毫升含药血清中哈巴俄苷的量为1.88 μg。
       3  讨论
        实验中采用《中国药典》2005版玄参项下的色谱分析方法，但在测定浸膏样品时，20 min左右有一个较大的峰出现，若此时停止样品的测定，即进下个样品时，会影响后续测定，所以将时间延长到25 min；在测定完一个样品时，需要将流动相调至初始比例，运行4 min左右，等柱压稳定在初始水平时，即可进样，否则哈巴俄苷色谱峰的保留时间容易受影响；测定样品时发现当室温在17℃以上时，哈巴俄苷色谱峰的分离度R＞1.5，当温度过低时，哈巴俄苷色谱峰受干扰峰影响，分离度R＜1.5，因此，室温应维持在17℃以上。
       
       有文献［3］报道玄参中哈巴俄苷的提取溶剂采用30%甲醇提取效果较好，因此本实验在考察甲肿消样品的预处理方法时，重点考察了提取时间、溶剂用量和提取次数，结果显示当提取时间为30 min、提取3次时，能较完全地提取哈巴俄苷成分，因此试验采用提取3次，每次提取时间分别为30，20，20 min进行样品制备。
       
       由于大鼠血清中哈巴俄苷含量很低，采用常规液液萃取方法哈巴俄苷的浓度很低，难于定量，回收率也不高。因此试验中采用固相萃取法处理血清样品，经精密度和回收率实验证明本方法可行，可用于测定血清中哈巴俄苷的含量。
       【参考文献】
         1］国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，2005:76.
       
       ［2］谢丽华，刘洪宇，钱瑞琴，等.哈巴苷与哈巴俄苷对阴虚小鼠免疫功能及血浆环化核苷酸的影响［J］.北京大学学报（医学版），2001，33（3）：283.
       
       ［3］蔡少青，谢丽华，王建华，等. 中药玄参中哈巴俄苷与肉桂酸的高效液相色谱法测定［J］.药物分析杂志，2000，20（3）：191.