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       【摘要】 
       目的深入探讨千层塔合剂治疗AD的作用机理，为中医和地方特色药物治疗AD提供实验依据和临床指导。方法采用腹腔注射D-gal 6周致亚急性衰老模型，合并双侧海马区注射Aβ25-35复制AD模型；给予药物或生理盐水灌胃4周后，取大鼠海马区组织行形态学及超微结构的观察。结果千层塔合剂能够明显改善AD大鼠海马CA1区形态学及超微结构的改变。结论千层塔合剂能够通过改善AD大鼠形态学及超微结构，抑制细胞凋亡，从而起到较好的治疗AD的作用。
       【关键词】  千层塔合剂； 老年性痴呆； 病理改变； 细胞凋亡
         随着世界人口的快速老龄化，老年性痴呆（Alzheimer"s disease，AD）的高患病率及其对社会、家庭的影响受到广泛重视。欧美等11个国家的联合研究报道欧洲60岁以上AD患病率为0.3%～10.8%［1］；而国内的调查报道显示AD患病率为0.85%～4.60%，例如北京对60岁及以上老人抽样调查中发现，AD的发病率占7.5%，上海在两次大规模的流行病学调查中显示60岁以上老人老年性痴呆占2.21%～4.69%［2］。因此，加强对AD的病因、发病机制的研究，开发有效的防治措施和药物有着极其重要的临床价值和现实意义。本课题认为年老肾虚髓衰，痰血瘀滞致脑窍失养是老年性痴呆的主要病机，根据多年临床经验，制成千层塔合剂，临床疗效显著。本课题在既往研究的基础上［3］，采用腹腔注射D-gal致亚急性衰老模型，合并双侧海马区注射Aβ25-35制备AD模型，用光镜、透射电镜观察大鼠海马区超微结构改变，从而寻求AD的最佳动物模型，并深入探讨千层塔合剂治疗AD的作用机理，为中医药和少数民族特殊用药治疗AD提供实验依据和临床用药指导。
       1  材料与仪器
       1.1  动物与药物
       13月龄Wistar 雄性大鼠60只，体质量（310±10）g，由湖北省疾病预防控制中心实验动物中心提供。千层塔合剂口服液，由湖北民族学院医学院附属医院制剂室提供，每毫升含生药2.5 g，成人每日用量为60 ml。将其原液作为高剂量，加等量蒸馏水配置的药液为低剂量备用。高、低剂量组分别相当于含生药2.5，1.25 g/ml。脑复康，0.4 g/片，100片/瓶，东北制药总厂生产，批号，20070628。取脑复康片28片研细，加蒸馏水配成20 mg/ml的悬浊液备用。D-gal，国药集团化学制剂有限公司生产，批号：F20061025。Amyloid β-protien(Aβ25-35)：SIGMA公司，A4559  Lot：027K4796。
       1.2  仪器与试剂
       大鼠脑立体定位仪，西安万东仪器有限公司生产 。日立H-600型透射电镜，日本日立公司生产。LKB-V型超薄切片机，瑞典BROMMA公司生产。光学显微镜，日本Olympus公司生产。
       2  方法
       2.1  动物分组与造模将大鼠随机分为6组，即正常组、假手术组（简称空白组）、模型组、脑复康治疗组（简称脑复康组）、千层塔合剂低剂量组（简称千低组）、千层塔合剂高剂量组（简称千高组），每组10只。
       
       动物适应性喂养1周后，模型组、脑复康组、千低组、千高组大鼠腹腔注射5% D-gal（100 mg·kg-1·d-1）。6周后，模型组、脑复康组、千低组、千高组大鼠在1%戊巴比妥（40 mg·kd-1）腹腔注射麻醉后（全身肌肉松弛10 min左右为麻醉成功），脑立体定位仪固定头部，头部备皮，常规消毒手术区皮肤，无菌条件下沿颅顶中线做1～2 cm切口，用湿棉球分离骨膜，暴露前囟，参照大鼠脑立体定位图谱［4］，立体定位海马后（以前囟为零点，AP=-3.5 mm，ML=±2.0 mm，DV=3.0 mm），用牙科钻颅骨钻孔，推进微型进样器注射针，将1 μl浓度为1 μg/μl的Aβ25-35，分别在5 min内缓慢注入双侧海马，留针5 min，缓慢退针后，以双氧水清洗创面，海绵胶贴封颅骨孔，缝合手术切口并涂马应龙痔疮膏，肌肉注射青霉素10万U防感染。空白组等位点注入等剂量的生理盐水，清醒后放回笼中常规饲养，正常组不予处理。
       2.2  动物给药手术3 d后，千层塔低、高剂量大鼠按照10 ml·kg-1·d-1分别给予相应的该药水煎液灌胃，脑复康组按照10 ml·kg-1·d-1给予脑复康混悬液灌胃；空白组、模型组给予等容积的生理盐水灌胃，连续4周。
       2.3  指标检测
       2.3.1  大鼠海马CA1区形态学观察行为学测试（行为学有显著性，在整理论文另发表）完成后第2天，大鼠断头处死，并立即在冰台上开颅，快速取出大脑，取左侧脑组织海马部位用刀片切成厚度约4 mm的小块，用含有l/l000DEPC的4%多聚甲醛/0.1MPBS溶液及时固定40min (4℃)，依次进行常规脱水、浸蜡、石蜡包埋、冠状切片，切片厚度4 μm，每个组织块连续切片35张，光镜观察。
       2.3.2  大鼠海马CA1区超微结构观察行为学测试完成后第2天，大鼠断头处死，并立即在冰台上开颅，快速取出大脑，取右侧脑组织海马部位，2.5%戊二醛前固定，0.1 mol·L-1磷酸缓冲液漂洗3次，锇酸（O3O41%）后固定，0.1 mol·L-1磷酸缓冲液漂洗3次，梯度酒精脱水（50%，70%，80%，95%，100%二次）每次15 min。纯丙酮脱水2次（15 min），EPON812∶丙酮（1∶1）浸透30 min，纯包埋液浸透1 h，纯包埋液固化37℃24 h后60℃48 h。LKB_V型超薄切片机切片，铀、铅染色（醋酸双氧铀）后电镜观察。
       3  结果
       3.1  千层塔合剂对AD模型大鼠海马CA1区形态学的影响各组光镜观察。结果见图1。
       
       正常组：海马神经元细胞饱满，结构清晰，细胞数目较多，大小一致，排列整齐紧密，胞质丰富，细胞层数多，无胞核染色加重。
        空白组：海马各神经元细胞未见减少，神经元数目和形态与正常组比较无明显差异。
        模型组：神经元数目明显减少，层数减少甚至单层，细胞体积增大，细胞内脂褐素大量沉积，胞核空泡变性染色加重，染色质密度增高聚于核膜周边，核仁变小、裂解，胞质增多，细胞排列混乱，部分神经元消失。
        脑复康组：神经元数目较千层塔合剂治疗组少，细胞核空泡变性染色有加重但较模型组有改善，胞质增生不明显，细胞排列不完全整齐。
        千低组：神经元数目与形态较千高组稍差，但明显好于模型组。神经元未见减少，排列基本整齐，胞质增生不明显。
        千高组：神经元数目多，细胞面积大，层数多，细胞紧密整齐排列，细胞数目接近空白组，脂褐素沉积不明显，无空泡变性等表现，明显好于其他各治疗组。
       3.2  千层塔合剂对AD模型大鼠海马CA1区超微结构的影响各组透射电镜观察。结果见图2。
        正常组：神经元细胞紧密排列，高尔基体等细胞器结构清晰，胞核清亮边缘光滑，双层膜结构明晰，胞质中可见丰富线粒体，线粒体无水肿，粗面内质网和核糖体（尼氏小体）数量丰富。
        空白组：神经元细胞连接偶有增宽（细胞周围偶有空洞），胞核清晰，胞膜略微增厚，细胞胞浆中个别线粒体轻微水肿。
        模型组：胞核异染色质涤染、凝聚、趋边，在核膜下形成结节或团块，核膜增厚或畸变，核皱褶或明显固缩状态，有明显核孔，胞浆中可见内质网扩张，线粒体水肿，线粒体基质透光度增加甚至消失，嵴断裂、减少乃至消失，变性而中空的线粒体使神经元胞质空泡化，可见形态不一、大小不等的大量脂褐素及溶酶体增大等，这些现象说明神经元细胞凋亡。
        脑复康组：神经元细胞胞浆中线粒体水肿、数目减少，线粒体基质透光度增加，粗面内质网偶有扩张或膜结构断裂，核糖体数目减少，少量脂褐素，细胞核周池不清，染色质仍有凝聚改变，细胞间连接部位水肿明显，连接增宽。
        千低组：神经元细胞胞核基本清晰，胞浆水肿，少量线粒体肿胀，未见脂褐素，溶酶体形态规则，神经元细胞连接部位水肿增宽，总体观察，神经元细胞比模型组好。
        千高组：神经元细胞胞核清晰明亮，双层核膜显见，形态规则，胞浆中可见较为丰富的线粒体，线粒体水肿不明显，粗面内质网发育良好，核糖体较多，有丰富的尼氏小体，细胞间连接较为紧密，可见无神经元细胞凋亡。
       4  讨论
        可靠的动物模型是研究AD发生、发展机制及防治措施、疗效评价的关键。本课题采用腹腔注射D-gal致亚急性衰老合并海马注射Aβ25-35的多因素复合AD模型，在以往的实验已经证实其学习记忆变化和海马区C-FOS的表达贴近AD，本实验在此基础上发现其病理变化也贴近AD，说明本造模方法具有可行性，较其他AD动物模型更能全面反映出AD的病理特征［5］。
        脑的衰老改变主要见于海马和大脑皮质，特别是海马CA1区是对脑老化最敏感的区域［6］。经研究发现，皮质和海马区的神经元减少是AD的主要病理特征，而神经细胞凋亡是AD神经元丢失的主要原因［7］。
        大量研究表明，AD的发病与脑能量代谢障碍有着密切的关系。作为能量代谢的主要场所，线粒体对神经元的功能有着重要意义［8］。当线粒体和内质网的膜结构氧化损伤后，将使大量Ca2+进入胞质，细胞将发生Ca2+超载，使线粒体发生肿胀，甚至功能障碍，导致神经元的能量代谢障碍，神经元发生退行性变化。线粒体反复加重的损伤影响了神经元的功能，也启动了神经元的凋亡过程［9］。在千层塔合剂治疗组神经细胞中，线粒体水肿和变性明显减轻甚至消失，结果提示，千层塔合剂具有增强细胞能量代谢，提高细胞活力，延缓脑的老化，从而激发和增强脑的智能作用。
       
       在细胞衰老过程中，神经细胞核中DNA的复制和RNA转录功能降低或失常，可见核被膜褶皱内陷，甚至固缩，异染色质凝集趋边，细胞膜破损，胞浆溶解空泡化［10］。本实验千层塔合剂组神经元细胞核形态基本规整，核基质基本正常，这一结果提示，千层塔合剂具有维持核结构正常、预防核功能衰退的作用。脂褐素是细胞衰老的形态标志之一［11］，它不直接损害细胞，但积累过多时，可因占据细胞有效空间而影响细胞代谢活动。本实验千高组光镜下未见脂褐素沉积，透射电镜显示，在千层塔合剂组神经元中，脂褐素明显减少甚至消失。结果提示，千层塔合剂具有推迟或减少脂褐素的出现和堆积的作用。在模型组神经细胞中，粗面内质网明显减少且肿胀，这表明衰老的神经细胞的蛋白合成减慢，细胞代谢率降低。而在千层塔合剂组神经细胞中，粗面内质网和核糖体明显增多、发育良好，肿胀明显减轻，甚至有丰富的尼氏小体。结果提示，千层塔合剂具有维持粗面内质网结构正常、减轻或推迟细胞代谢能力降低的作用。
        有研究表明，Aβ诱发的自由基损伤致神经细胞凋亡可能是AD病理现象的最终结局［12］，因为Aβ所致的神经元损伤或脱失均有凋亡相关信号的出现，因而认为凋亡可能是AD中神经元选择性死亡的主要机制［13］。本超微结构实验结果表明，千层塔合剂对AD大鼠海马CA1区形态学及超微结构均有良好的改善作用，能够明显地抑制神经元细胞退行性改变及神经元凋亡，这可能是该方抗衰老以及改善老年性痴呆患者学习记忆能力的重要神经生物学基础，揭示了千层塔合剂在防治老年性痴呆以及抗衰老方面有着广阔的开发应用前景。
        本课题基于肾虚髓衰、痰血瘀滞是对老年性痴呆发病的基本病因病机的认识，以补肾填髓活血化痰为原则，用千层塔、川芎、制首乌、白芥子等药制成千层塔合剂。方中千层塔性平味辛，有散瘀之效，制首乌甘涩、微温，能补益精血固肾共为方中主药；川芎辛温，能温能散活血化瘀；白芥子辛温走散，善治“皮里膜外之痰”；全方共奏补肾填髓、祛瘀化痰之效，遵循了“实则泻之，虚则补之”“治病求本”的治疗法则，使肾精得补，脑髓得充，痰瘀自去，脑主神明的功能正常发挥，故痴呆症状得以改善，智慧生生不息，是抗衰老、治疗老年性痴呆的良方。验之临床，确有良效。本实验证实千层塔合剂从形态学及超微结构改善了AD大鼠的病理学改变，说明千层塔合剂对学习记忆相关脑区结构的保护和改善作用或是千层塔合剂防治老年性痴呆、抗衰老的神经生理学机制之一。
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