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       【摘要】 
       目的从已分离的具有红景天苷转化能力的霉菌中，筛选能协同发酵红景天苷的双菌株组合。方法以重氮盐比色法初步确定菌株组合和双菌株协同主要发酵条件，并用高效液相色谱(HPLC)法复筛。结果选出的最优双菌株组合编号为35-42，该组合在最优发酵条件下，发酵后红景天中红景天苷和酪醇含量比原药材分别提高86.29%和118.14%，总有效成分提高94.68%。结论表明双菌株的协同转化作用明显优于单菌株。
       【关键词】  双菌株发酵； 红景天苷； 酪醇； 重氮盐比色法； 高效液相色谱
        红景天为景天科（Crassulaceae）红景天属Rhodiola crenulata Hook.f.et Thoms植物的根及根茎［1］，我国红景天资源大多分布在高寒地区。其有效成分主要是红景天苷及其苷元-酪醇，二者均具有抗缺氧、抗疲劳、抗微波辐射、抗病毒、抗肿瘤等作用。红景天制品是抗高原反应的必备品。随着红景天产品广泛开发和应用，过度采挖使天然资源日趋枯竭［2］，对高原藏区生态环境的破坏严重。因此，保护性开发野生资源，提高红景天有效利用率显得更加重要。在其他一些植物药材中，苷是从无活性的苷元脱去糖基获得的，可以采用酸解或酶法来水解糖基，简便易行。与之不同，红景天苷和苷元生成是合成代谢，其前体来源不太清楚，从而造成提高其有效成分研究的难度。目前已有的研究主要包括：添加前体物和酶催化剂合成红景天苷、化学合成法［3］、植物细胞组织培养和基因克隆等方法［4,5］，但与应用还有不小距离。文章在前期研究中，已分离到对红景天苷具有转化能力的菌株，通过单一菌株发酵，最高可使红景天原药材中苷含量提高52.83%。本研究进一步采用双菌株协同发酵红景天，使其中苷含量大大高于单一菌株发酵。混合菌株发酵提高红景天苷和酪醇含量研究还未见报道,为利用生物技术提高野生藏药材资源利用率提供新途径。
       1  材料
        红景天购于成都五块石药材市场，经四川大学生命科学学院许介眉教授鉴定系景天科（Crassulaceae）红景天属Rhodiola crenulata Hook.f.et Thoms。菌种：本实验室保存，除2号为米曲霉外，其余菌株均为黑曲霉。    培养基：红景天发酵培养基：红景天粉与水以1∶10的比例。固体种子培养基：麸皮∶水=1∶1。液体种子培养基：麸皮∶水=1∶5，煮沸20 min，过滤，取滤液，加MgSO4  0.05%， KH2PO5  0.1%，(NH4)2SO4  0.1%。试剂：酪醇标准品、红景天苷标准品均购于成都思科华有限责任公司，甲醇为一级色谱纯。
       2  方法
       2.1  培养方法
       2.1.1  孢子悬液制备将菌株接种于固体种子培养基，30℃培养48 h，加水洗下孢子，稀释至孢子浓度约108个/ml。
       2.1.2  菌丝体制备按0.1%接种量将孢子悬液接入液体种子培养基，30℃，200 r/min，时间48 h。
       2.1.3  红景天发酵培养30℃，200 r/min，时间为2～4 d。
       2.2  提取方法红景天发酵液用75%的乙醇按照1∶8的比例分别提取3次，合并滤液，得到发酵提取液，用于重氮盐比色法测定和HPLC检测。
       2.3  测定方法
       2.3.1  重氮盐比色法［6］取发酵提取液5 ml，加入10%的醋酸铅5 ml和饱和硫酸钠2 ml，定容至25  ml，沉淀、离心，取上清液5 ml于20 ml比色管中，其中加2%碳酸钠3 ml及重氮化试剂3 ml，摇匀显色5 min，再加5%氢氧化钠0.5 ml，显色15 min，整个过程在4℃以下进行，稀释10倍，在489 nm波长下测定吸光度。以吸光度高低作为总有效成分（苷和酪醇的总量）的初筛指标。
       2.3.2  HPLC检测［7］色谱条件：岛津LC-6A 高效液相色谱仪；色谱柱为YWM-C18(10u)200 nm×4.6 mm；流动相为V（甲醇）：V（高水）=25∶75 ；检测波长275 nm；自然pH；柱温为室温；进样量：20 μl；流速1.0 ml·min-1。精密称取红景天苷、酪醇标准品25.00 mg，分别置于25 ml的容量瓶中，无水乙醇溶解定容，制成浓度为1.00 mg·ml-1的标准品，取苷标准品溶液进样2，4，6，8，10，12 μl，酪醇标准品溶液进样1，2，3，4，5，6 μl，测定峰面积，以峰面积（Y）与对照液中红景天苷和酪醇的质量（X/μg）作回归计算，得到标准曲线。发酵产物中红景天苷和酪醇的含量测定按以上条件进行。
       3  结果
       3.1  双菌株初筛在本研究前期的菌株筛选工作中，已对重氮盐比色法和HPLC进行对比测定，证明重氮盐比色法测定红景天总有效成分的结果，与HPLC测定值有较好的相关性（另文发表）。从已分离到的微生物中，选出发酵能力较高的8株霉菌，两两组合，接种于红景天发酵培养基中进行混合菌株发酵，并与单菌株发酵比较。结果见表1和图1。表1  双菌株发酵红景天总有效成分测定（略）
        由表1及图1可以看出，22种双菌株组合中，83.33%的高于对照，22.72%高于单菌株发酵，其中有4对组合高于对照170%以上（高于单菌株发酵29.27%以上）。
       3.2  双菌株复筛以峰面积（Y）与对照液中红景天苷的量（X/μg）作回归计算，结果表明红景天苷含量在2.00～12.00 μg范围内线性关系良好，回归方程为：Y= 7 684 080.042  9X+ 64 169.261 9，r=0.999 7（n=6）；以峰面积（Y）与对照液中酪醇的量（X/μg）作回归计算，结果表明酪醇含量在2.00～12.00 μg范围内线性关系良好，回归方程为：Y=1 180 000X-7 624.23，r=0.999 8（n=6）。将初筛中有效成分最高的7个双菌株组合，接种于红景天发酵培养基中发酵，用HPLC测定其中红景天苷和酪醇的含量，算出百分含量。结果见表2及图2。表2  双菌株发酵红景天苷和酪醇的含量（略）
        由表2可以看出，在单菌株发酵中，红景天苷和酪醇分别以35号和49号菌株最高；双菌组合发酵后，酪醇含量均低于49号单菌株，但35-42菌株组合发酵后红景天苷和总有效成分含量，均明显高于所有单菌和其余双菌株发酵。35-42组合发酵后红景天苷、酪醇和总有效成分分别比原药材提高44.36%，26.83%和39.74%，均高于所组合的单一菌株35号和42号。
       3.3  接种方式的确定将7种双菌株组合分别采用孢子悬液和菌丝体进行接种发酵，用重氮盐比色法测定红景天总有效成分的含量。结果见表3。表3  孢子悬液和菌丝体接种发酵的比较（略）
        由表3可以看出，以孢子悬液接种发酵，发酵提取液吸光度平均值为0.522，而以菌丝体接种，发酵提取液吸光度平均值为0.561，后者约是前者的1.055～1.120倍。表明用菌丝体接种优于孢子悬液。在这两种接种方式中，均以35-42菌株组合最好，因此选定该双菌株组合作进一步试验。
       3.4  主要发酵条件的优化以35-42为组合菌株，通过正交实验对红景天主要发酵条件进行优化，用重氮盐比色法测定红景天总有效成分的含量。结果见表4。表4  35-42双菌株组合发酵正交实验设计（略）
        通过正交实验得到红景天发酵最佳条件为；接种量10％、固液比1∶10、生长时间60 h。试验结果表明，接种量过大时，菌体之间相互缠绕，不利于菌体的发酵；固液比过低，发酵液中营养成分过低，限制菌体生长；时间太短，影响前体的产生和红景天苷及酪醇的合成。
       3.5  双菌株接种比例的确定以正交实验所得最佳条件为基础，将 35号和42号菌株以不同比例混合接种发酵红景天，通过HPLC来检测红景天苷和酪醇含量，求得百分含量。结果见表5。表5  35-42双菌株不同接种比例组合发酵后红景天苷和酪醇含量（略）
        由表5可得，35-42双菌株混菌比例为2∶8时红景天苷和总有效成分最高，这是由于混菌发酵利用不同菌株作用效果的差异，适宜的接种比例可以使代谢协调，从而提高产率。
       3.6  35-42双菌株组合的发酵曲线和发酵时间的确定以HPLC测定35-42双菌株发酵不同阶段红景天苷和酪醇的含量。结果见图2。
        由图2可以看出，双菌株组合接种6 h后红景天苷逐渐增加，在60 h达到最大值，此后逐步降低。酪醇含量在0～54 h内变化不大，但在红景天苷接近峰值时，开始下降，总有效成分在54 h达到最大值，此后，随着酪醇的下降而降低。由于红景天质量检验是以苷的含量为准，因此将发酵时间确定为60 h。
       3.7  最优发酵条件下双菌株发酵液中红景天苷和酪醇含量分析按照以上确定的最佳发酵条件，即：菌丝体接种，接种量10%，双菌株的混菌比例为2∶8，配料水比为1∶10，30℃ 200 r·min-1条件下转化发酵60 h，以红景天原药材提取液以及单菌发酵的提取液作对照。单菌和双菌发酵提取液均与原药材提取液的测定稀释度相同（含相同原始质量的红景天原药材）。用HPLC检测红景天苷和酪醇并测定含量，结果如图3～6。
       由图4～6的HPLC色谱图显示，红景天原药材提取液、单株菌发酵和双菌株发酵的提取液中，在3.8min和11.2min均出现吸收峰，红景天苷标准品和酪醇标准品的保留时间一致。35-42双菌株发酵的吸收峰面积明显大于原药材对照以及单株菌发酵液的吸收峰面积。HPLC测定数据见表6，结果表明，经过35-42双菌株发酵后，红景天中红景天苷含量提高86.29%，酪醇含量提高118.14%，总有效成分提高94.68%。红景天发酵液中红景天苷和酪醇含量与原药材对比，结果见图7～9。表6  35-42双菌株在优化发酵条件下红景天苷和酪醇含量分析（略）
       4  结论
        本研究通过筛选微生物双菌株对红景天原药材进行发酵，可以显著增加红景天苷和酪醇的含量。微生物具有丰富的代谢多样性和很强的代谢能力，高等植物体内所有的代谢途径，在微生物中都有可能存在并且活性更强。 在红景天苷合成中，通过苯丙烷类代谢途径，为酪醇的合成提供含苯环的碳架结构，再由转移酶催化尿苷二磷酸葡萄糖与酪醇与合成红景天苷。本研究所用真菌与红景天同属真核生物，能催化前体转化为红景天苷和酪醇，可能具有与红景天中类似的部分酶及代谢途径，并能产生淀粉酶、蛋白酶等胞外水解酶，在红景天原料上生长时，分解植物组织，促进物质的溶出，产生更多的前体物，为红景天苷和苷元合成提供充足的物质来源。红景天苷和苷元的合成需要多种酶的催化，而单一菌株很难在多个环节上同时提高中间代谢物的量。双菌株发酵中，酶系比例相对协调，形成代谢协同作用，使红景天苷含量大大提高。
       
       经初步测算，双菌株发酵使红景天原药材中红景天苷提高86.29%，已大大超过盈亏平衡点，具有很强的应用前景。后续需要在菌种选育、发酵机理、药效和中试工艺条件进行研究。
       【参考文献】
         1］龚晨睿，李宇红，马良．红景天复合制剂抗疲劳作用研究［J］.卫生研究，2002，31(5)：397.
       
       ［2］包文芳，吴维春，李葆华，等．抗疲劳药用植物红景天［M］.北京：人民军医出版社．2004，2：1．
       
       ［3］张莉，赵淑月，郑恺，等．红景天植物的抗自由基作用研究［J］.长春中医学院学报，2002，18(1)：44．
       
       ［4］王莉．长鞭红景天细胞悬浮培养及其次生代谢调控研究［D］.北京：北京林业大学药用植物学，2007．
       
       ［5］贾艳萍，郭宏艳，张春枝，等．微生物酶合成红景天苷的条件优化［J］.大连轻工业学院学报，2004，23（2）：97.
       
       ［6］蔡鹰，张梅．红景天胶囊中红景天苷的含量测定［J］.中国药师，2003，6(7)：428.
       
       ［7］J．F．Xu， C．B．Liu， A.M．Han，et al． Strategies for the improvement of salidroside production in cell suspension cultures of Rhodiola sachalinensis［J］. Plant Cell Reports，1998，17：288.