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       【摘要】 
       目的对几种天然药物进行植物雌激素的活性筛选。方法采用人乳腺癌细胞增殖法与酵母菌雌激素筛检实验法对9种天然药物进行了植物雌激素活性的研究。结果成功地建立了E-SCREEN法与Yeast Estrogen Screen实验法，此两种方法均可检测到1×10-13 mol/L的雌二醇。MCF-7细胞增殖实验结果表明，鹰嘴豆、新疆石榴皮、罗勒、枸杞水提取物可促使ER（＋）MCF-7细胞的增殖（P＜0.05），提示它们具有植物雌激素样活性；酵母双杂交（Yeast two-hybrid）系统实验结果表明，鹰嘴豆、石榴皮水提取物均能使酵母系统中的β-半乳糖苷酶的活性增强（P＜0.05），提示它们具有植物雌激素样活性。结论E-SCREEN法敏感性高，并有快速、简便等优点，适用于大量化合物的初选。
       【关键词】  人乳腺癌细胞增殖法； 酵母菌雌激素筛检实验； 雌激素活性
        长期以来,许多中草药植物被广泛应用于妇科病的治疗和保健［1］，中药所含植物雌激素成分在其中发挥的药效作用不容忽视。因与雌激素化学结构相似［2］,植物雌激素是植物中可以与哺乳类动物及人类的雌激素受体(Estrogen Receptor, ER)相结合并将其激活的一类化合物,被证实存在于包括中草药在内的多种植物中,而且在体内具有双向调节作用,即一方面在体内雌激素水平较低时,可与ER结合发挥雌激素样作用；另一方面,在体内雌激素水平较高时,植物雌激素可通过竞争性结合靶细胞ER而产生抗雌激素样作用,即减弱靶细胞对雌激素的应答。因此,近年来植物雌激素又被称为“选择性雌激素受体调节剂”(selective estrogen receptormod-ulators, SERMs)或中药选择性雌激素受体调节剂。对中药植物雌激素活性筛选、活性成分及其作用机制、特别是关于这些成分对雌激素依赖性肿瘤细胞增殖的影响的研究尚不够深入。本研究在上报的茯苓等中药雌激素活性筛选的基础上，选择课题组正在研究的富含黄酮类、香豆素类、木脂素类及二苯乙烯类成分的新疆石榴皮、红景天、罗勒、阿里红、枸杞、肉苁蓉、锁阳、鹰嘴豆、新疆鼠尾草等9种天然药物，对其植物雌激素活性进行了初步的筛选。
       1  材料与仪器
       1.1  药物新疆石榴皮Punica granatum L. （购自新疆南疆）；罗勒Ocimun basilicum L. （采自新疆吐鲁番市）；红景天Rhodiola rose L.（购自新疆伊宁霍诚县）；阿里红Fomes officinalis Ames.（购自新疆维吾尔医院）；鹰嘴豆Cicer arietinum L.（购自新疆维吾尔医院）；枸杞Lycium barbarum L. （购自新疆中新药业公司）；肉苁蓉Cistanche salsa.（采自新疆吉木萨盐生肉苁蓉人工栽培基地）；锁阳Cynomorium songaricum Rupr.（购自新疆乌鲁木齐市）；鼠尾草Salvia deserta Schang.（采自乌鲁木齐市近郊）。各药材分别用10倍量水煮提2次，过滤，合并滤液并减压浓缩，真空干燥后配制成1 mg/ml的水提液。
       1.2  试剂EMDM培养基、无酚红EMDM培养基、17β-雌二醇、β-半乳糖苷酶、S.cerevisiac酵母菌株、SD培养基、Zymolase试剂（为Sigma公司产品），邻硝基苯-β-D-半乳吡喃糖苷（ONPG，日本和汉药研究所提供），胎牛血清（FBS，日本和汉药研究所提供），其余试剂均为日本产分析纯。
       1.3  仪器电子读数分析天平(日本 Shimaduz 公司)；二氧化碳培养箱(日本SANYO公司),倒置显微镜(日本Olympus)；台式高速低温离心机(美国Becton Dickinson公司)；全温振荡培养基(美国Becton Dickinson公司)；BIO-RAD Model 3550-UV紫外分光光度仪(日本SANYO公司)；25 mm2培养瓶、96孔培养板（美国Becton Dickinson）。
       2  方法与结果
       2.1  细胞株及培养条件 
       雌激素敏感的MCF-7人乳腺癌细胞由日本和汉药研究所提供。以含5%胎牛血清（Hyclone）的DMEM培养基培养传代。培养条件：37℃，5%CO2，相对湿度95%。
       2.2  细胞增殖实验 
       按E-screen法［3］并稍作修改，普通培养的MCF-7细胞经胰蛋白酶消化后以104个细胞/ml接种于96孔细胞培养板中，每孔100 μl，贴壁24h后去除原培养基，换成实验用培养基：无酚红的DMEM基加10%热灭活的无雌激素人血清，继续培养5 d，此时加入阳性（雌二醇）对照组设10-13～10-9mol/L 5个浓度，不同浓度的受试物和阴性（溶剂）对照组，每个浓度设6个复孔。6d后弃上清液，每孔加5mg/ml的四唑盐（MTT）30 μl，继续培养4 h。吸去孔中的培养液，每孔加入150 μl的DMSO，在540 nm波长测定吸光度并计算增殖率。结果见表1。
       
       阳性对照(雌二醇)从浓度10-13～10-9 mol/L对MCF-7人乳腺癌细胞增殖力与对照组相比均有显著性,并在10-10mol/L组实验对MCF-7细胞增殖力最强,与其它各组相比差异有显著性。说明本次实验结果是可靠的。在此实验条件下，高剂量组鹰嘴豆（P＜0.05）、石榴皮（P＜0.01）、罗勒（P＜0.05）、枸杞（P＜0.05）水提液与正常对照组均有显著性差异；在低剂量组鹰嘴豆（P＜0.01）、石榴皮（P＜0.01）、罗勒（P＜0.01）水提液与正常对照组相比有统计学意义；而鼠尾草、肉苁蓉、锁阳、阿里红、红景天水提液与正常对照组相比无统计学差异（P＞0.05）。
       2.3  酵母菌株和培养基的建立 
       过夜培养的酵母转种至新的SD液体培养基中，加入不同浓度的植物提取物，于30℃恒温振荡器中培养4 h，然后在595 nm测定吸光度。
       2.4  β-半乳糖苷酶活性的测定 
       测定并记录培养液的OD595，离心，弃取上清液，加入Zymolase 溶液，置37℃水浴中培养15 min，再加入ONPG溶液，置30℃水浴中培养30 min，加入1 mol/L Na2CO3100 μl终止反应。在450 nm，540 nm波长测定吸光度，并计算β-半乳糖苷酶活性（U）值。结果见表1。表1  MCF-7细胞增殖实验与酵母菌筛检实验结果（略）
        （U）值=1 000×（A450－1.75×A540）/(ONPG反应时间t×0.05×A595)
        
       溶剂对照组的β-半乳糖苷酶活性为48.5，阳性对照组的酶活性为440.5，与溶剂对照组有显著差异（P＜0.05），说明本实验系统可靠，可用于对含有雌激素的样品进行雌激素活性的测试。在此实验条件下，鹰嘴豆（P＜0.05）、石榴皮（P＜0.05）水提液在高、低剂量组均与溶剂对照均有统计学差异；而枸杞、鼠尾草、肉苁蓉、罗勒、锁阳、阿里红、红景天水提液与溶剂对照组相比无统计学差异（P＞0.05）。
       2.5  统计学处理 
       所有数据均为3个重复的平均值，并表示为±s。利用Dunnett′s 进行统计学处理。
       3  讨论
        近年来,在围绝经期综合征等妇科病的治疗中,雌激素替代疗法因副作用明显［4］，人们将更多的关注投向了植物雌激素以及含有植物雌激素成分的中草药及其复方。以此为切入点，采用目前较常用的筛选雌激素方法——人乳腺癌细胞MCF-7细胞增殖实验，从影响ER阳性MCF-7细胞增殖的角度进行了研究，结果显示：石榴皮、罗勒、鹰嘴豆、枸杞水提物均能使ER阳性MCF-7细胞增殖，提示它们具有拟植物雌激素样活性，因中药植物雌激素与雌二醇结构的相似性，可能与雌激素受体相结合而发挥一定的雌激素效应。该作用与这些中药所含的木脂素、香豆素、黄酮类成分有关。
       酵母双杂交技术是Fields等于1989年提出，是在重组基因酵母法基础上发展起来的一种新的环境雌激素物质的检测方法［5］，是基于核激素受体和辅激活蛋白之间的配体依赖作用而建立起来的实验系统。在酵母双杂交系统中，雌激素受体（ERs）与酵母转录子GAL4的DNA结合域（DNA-BD）结合，辅激活蛋白与DNA转录激活域（DNA-AD）结合，构建质粒。由于ER与辅激活蛋白相互作用BD与AD在空间上接近，从而激活GAL4的激活序列（UAS）下游启动子调节的lac-Z报告基因表达，产生β-半乳糖苷酶。因此β-半乳糖苷酶的活性大小就和ERs与辅激活蛋白之间的相互作用强度大小一致。但只有在雌激素物质存在的情况下，ERs才能和辅激活蛋白结合，引起BD和AD在空间上接近，从而激活lac-Z报告基因表达，产生β-半乳糖苷酶。根据这一原理，通过测定β-半乳糖苷酶的活性即可反映受试物的雌激素样作用。
       
       近些年来，酵母双杂交法应用范围得到了较大扩展，不仅应用于检测那些用于发展新牙科聚合物的化学物质的雌激素活性［6］，也同时应用于检测和评价羟基化多氯联苯的雌激素和甲状腺激素活性［7］，以及评价多种化合物的抗雌激素活性［8］和天然药物的雌激素活性的筛选研究［9］。本实验结果显示：鹰嘴豆、石榴皮水提液均能使酵母系统中β-半乳糖苷酶活性增加，表现出具雌激素样作用。
       
       有机体是一个复杂的体系，体外实验结果仍需整体动物实验加以验证。因此，应当注意在选择进行体外实验的同时，为了避免实验结果的假阳性和假阴性，再进一步进行传统的体内实验，以保证获得更加准确的结论。
       
       本研究用经典的E-screen和Yeast Two-Hybrid Assay实验，筛选了9种受试物的雌激素活性。以人乳腺癌MCF-7细胞增殖实验结果评价，石榴皮、鹰嘴豆、罗勒、枸杞均具有雌激素样活性；以酵母双杂交实验结果评价，石榴皮、鹰嘴豆有雌激素样活性。鼠尾草、肉苁蓉、锁阳、阿里红、红景天在两种体外实验筛选中均无显示出雌激素样活性，至于它们是否具有雌激素样作用还需从其它途径进行研究。
       【参考文献】
         1］王大伟,王继峰,牛建昭,等.中医药治疗更年期综合征的作用机理探讨［J］.北京中医药大学学报, 2007, 30(3): 213.
       
       ［2］Usui T. Pharmaceutical prospects of phytoestrogens［J］.Endocrine Journal ，2006, 53(1): 7.
       
       ［3］Eun-ni A，Teruaki A，Norio N，et al. Screening of medicinal plant extracts for estrogenic activity in combination with a glycosidase treatment ［J］.Journal of Traditional Medicines(J.Trad.Med), 2004, 21(2):81.
       
       ［4］Yusuf S, Anand S. Hormone replacement therapy: a time for pause［J］.Can Med Assoc, 2002, 167 (4):357.
       
       ［5］Joohee J, Kunie I, Teruaki A, et al. Anti-estrogenic activity of fifty chemicals evaluated by in vitro assays［J］. Life Sciences, 2004,74:3065.
       
       ［6］Hashimotoa Y, Moriguchi Y, Oshima H, et al. Measurement of estrogenic Vitro［J］. Nature，2001, 15:421.
       
       ［7］Shiraishi F, Okumura T, Nomachi M, et al. Estrogenic andthyroid hormone activity of a series of hydroxypoly-chlorinated biphenyls［J］. Chemosphere，2003, 34:33.
       
       ［8］Joohee J, Kunie I, Tsutomu N. Anti-estrogenic activity of fifty chemicals evaluated by in vitro assays ［J］. Life Sciences，2004, 74:3065.
       
       ［9］Eun-mi A, Norio N, Teruaki A, et al. Estrogenic and antiestrogenic activities of the roots of Moghania philippinensis and their constituents［J］. Biol. Pharm. Bull，2004, 27(4):548.