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       【摘要】 
       目的确定川木通RAPD-PCR反应各因素的最佳水平，最终确定RAPD-PCR反应的最佳反应条件。方法采用正交设计L16（45）在4个水平上对川木通类植物进行RAPD-PCR进行试验。两次结果分别用统计软件MINITAB进行分析。结果最终确定RAPD-PCR反应的最佳反应条件为：20 μl体系，其中含1×PCR buffer, 2.5 mmol/L MgCl2,0.15 mmol/L dNTPs,1.0 U Taq酶，0.5 μmol/L 10-mer引物，50 ng模板DNA，最终确定退火温度36℃。同时发现Taq酶对反应体系影响最大。结论建立了可靠的反应体系，为该类药材的分子鉴定奠定了基础。
       【关键词】  正交设计； 川木通； RAPD-PCR
           川木通类药材均来自于毛茛科铁线链属植物，该属植物我国共分布有108个种［1］，有些铁线莲属药用植物外形极为相似，有时非花期植株难以鉴别，经过药材加工后更加难以辨别，容易在应用中造成品种混乱，影响临床用药安全与疗效。因此，在具体开发使用本属药用植物资源时，应重视和加强对其品种的鉴定，以确保资源的正确合理使用。RAPD继承了PCR技术效率高，样品用量少（只需少量DNA样品），灵敏度高，检测容易等优点［2］，目前被广泛地应用于药用植物的分类鉴定工作。但PCR各因素水平对反应结果均有影响。目前关于川木通RAPD-PCR的反应体系优化未见报道，本实验采用正交设计L16(45)在4个水平上对川木通类植物进行RAPD-PCR进行试验，建立了较为可靠的反应体系。本工作为以后该类植物与药材的分子鉴定奠定了基础。
       1  材料
        本实验所使用的川木通原植物均为作者在四川各地实地采集，植物叶片采集后采用硅胶直接干燥，另外部分采集后直接编号用液氮保存，此后保存在-80℃冰箱备用，所采集植物均经过万德光教授鉴定后备用。
        
       Taq聚合酶、dNTP、T4连接酶、琼脂糖购自TaKaRa宝生物工程（大连）有限公司；RAPD引物购自北京赛百盛公司。
       2  方法
       2.1  植物总DNA的小规模提取与DNA浓度的测定提取方法按干滟等［3］的方法并稍加改进。测定浓度后稀释至50 ng/μl。
       2.2  PCR反应因素水平的确定与正交表的设计［4］为了确定PCR反应中的5个因素（Taq 酶、Mg2+、模板DNA、dNTP、引物）的最佳水平，采用正交设计L16(45)在4个水平上进行实验。参加PCR反应的因素水平见表1，L16(45)设计方案见表2。表1  PCR反应的因素水平μl水平（略）表2  PCR反应的因素水平L16(45)正交实验设计μl（略）
       
       将表2的16个处理重复两次，在PCR仪上进行扩增，结果电泳检测，记录。用统计软件MINITAB进行分析，得到川木通RAPD-PCR反应各因素的最佳水平，最后在PCR仪上，用此最佳因素水平的PCR反应体系进行梯度退火试验，筛选得到最佳退火温度。
       2.3  RAPD扩增在正交结果的基础上，建立了本实验所使用的体系［5，6］。RAPD扩增反应所采用的条件和体系如下：20 μl体系，其中含1×PCR buffer，2.5 mmol/L MgCl2，0.15 mmol/L dNTPs， 1.0UTaq 酶，0.5 μmol/L10-mer引物，50ng模板DNA，补ddH2O至终体积20 μl。PCR反应热循环程序如下：95℃预变性5min；36℃复性1 min；72℃延伸1.5 min；94℃变性1 min；36℃复性1min；72℃延伸1.5 min，35个循环。最后72℃延伸10 min，反应产物在4℃保存。
       2.4  电泳分析与结果统计DNA扩增产物在1×TAE的缓冲条件下，于1.5%琼脂糖凝胶分离，溴化乙锭染色。标准分子量为Tokara提供的DL2000 Marker。使用凝胶成像系统（GDS8000，美国UVP）拍照分析。
       3  结果
       3.1  电泳结果评分按照表2设计的16个处理进行PCR反应后，产物进行电泳。结果见图1。
       
       根据电泳结果，按照本实验目的，即以后将要进行的遗传多样性分析的要求将16个处理从高到低依次打分，条带数量越丰富、清晰度越高、背景低的最佳产物记为16分，与此相反，最差的记为1分［7,8］。两次重复分别独立设计，从两次重复的结果看，各个处理组合的反应都具有较高的一致性。两次记分分别为1，13，14，11，10，16，15，12，2，9，8，7，6，5，4，3和1，12，14，13，10，16，11，15，2，8，9，7，5，6，4，3。
       3.2  各因素对PCR反应影响的差异分析将上述处理结果用统计软件MINITAB(Minitab Inc.)进行方差分析。结果见表3。由F值可见，Taq 酶的影响最大，模板的影响最小，各因素对PCR反应的影响由大到小依次为：Taq 酶、引物、Mg2+、dNTP、模板。由于各因素水平间的差异均达到显著水平，可以进一步进行因素内多重分析。表3  PCR反应各因素间方差分析（略）
       3.3  因素内各水平对PCR结果的影响为了分析各因素的最佳反应水平，在方差分析的基础上，继续对每个因素各个水平作多重比较，评价结果如下。
       
       Taq酶的0.1与0.2，0.3与0.4水平差异不显著，其余组合差异显著。由于Taq酶对结果影响最大，0.3与0.4水平达到了反应的最佳效果，且水平间差异不明显，从经济角度考虑选择了0.3水平为最佳反应水平。
        Mg2+浓度对PCR结果影响明显，较为敏感，2.5水平表现最好，选择2.5水平作为本实验的最佳反应水平。
        模板DNA浓度在本实验梯度内无明显变化，本实验选择1作为标准。
        dNTP浓度对PCR反应结果影响具有明显的规律，在1～2水平上效果较好，其它高浓度效果较差。最终选择dNTP最佳水平为2。
       
       引物浓度最佳水平最终选择1。
        退火温度进行梯度实验后最终选择36℃。
        最终，RAPD-PCR反应的条件确定为：20μl体系，其中含1×PCR buffer，2.5 mmol/L MgCl2，0.15 mmol/L dNTPs，1.0 U Taq 酶，0.5 μmol/L 10-mer引物，50ng模板DNA，补ddH2O至终体积20 μl。PCR反应热循环程序如下：95℃预变性5 min；36℃复性1 min；72℃延伸1.5 min；94℃变性1 min；36℃复性1 min；72℃延伸1.5 min，35个循环。最后72℃延伸10 min，反应产物在4℃保存。
       4  讨论
        本实验借助正交设计优化PCR反应体系，使结果较以往的单因素实验更加科学、完善和简便，为以后的分子鉴定工作的标准化、高重复性奠定了基础。本方法在其它PCR类体系的设计优化上有一定的指导作用和示范意义。
       【参考文献】
         1］中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志(28卷)［M］.北京:科学出版社,1980:177.
       
       ［2］黎裕，贾继增，王天宇. 分子标记的种类及其发展［J］. 生物技术通报,1999,4:19.
       
       ［3］干滟，曾凡亚，赵云，等.油菜单株总DNA的快速制备［J］.四川大学学报(自然科学版),1999,36(5):936.
       
       ［4］谢运海，夏德安，姜静，等.利用正交设计优化水曲柳ISSR-PCR反应体系［J］.分子植物育种,2005,3(3):445.
       
       ［5］Bautista R, Crespillo R, Francisco MC ，et al. Identification of olive-tree cultivars with SCAR markers［J］. Euphytica，2002, 129: 33.
       
       ［6］Jia JH, Wang P, Jin DM, et al. The application of RAPD markers in diversity detection and variety identification of Porphyra［J］. ACTA Bot Sin，2000,42: 403.
       
       ［7］Mariniello L, Sommella MG, Sorrentino A et al. Identification of Prunus armeniaca cultivars by RAPD and SCAR markers［J］. Biotechnol Lett，2002，24: 749.
       
       ［8］Nybom H and Bartish IV. Effects of life history traits and sampling strategies on genetic diversity estimates obtained with RAPD markers in plants［J］. Perspect Plant Ecol Evol Syst，2000，3: 93.