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       【摘要】 
       目的通过体外实验探讨压力刺激对大鼠筋膜组织成纤维细胞周期和增殖指数（PI）的影响，为推拿基本力学刺激“舒筋散结”的治疗作用提供细胞生物学方面的实验依据。方法体外培养大鼠筋膜组织成纤维细胞，对细胞实施压力刺激后，检测细胞周期与PI变化。结果筋膜组织成纤维细胞接受压力作用后，细胞周期发生阻滞，休止期和DNA合成前期（G0/G1期）细胞增多，分裂前期（S期）细胞减少，PI降低，差异有统计学意义。结论压力刺激对筋膜组织成纤维细胞周期与PI的抑制性调节，可能是推拿“舒筋散结”的细胞生物力学原理之一。
       【关键词】  推拿； 压力刺激； 筋膜组织； 成纤维细胞； 舒筋散结； 细胞周期； 增殖指数
       Influences of Pressure Stress on the Cell Cycle Time and the Proliferation Index (PI) of Fibroblast Cells in SD Rat Fibrous Tissues in vitro
       CHEN Bo, LI Jialin, XIE Ximei, LI Xiaoyu
       1.Department of Acupuncture and Massage, Guiyang College of TCM, Guizhou 550002, China; 2. Key Laboratory of Oral Biomedical Engineering，Ministry of Education, Stomatology Medical College, Sichuan University, Chengdu 610041, China
       Abstract：ObjectiveTo study the influences of pressure stress on the cell cycle time and the proliferation index (PI)of fibroblast cells in SD rat fibrous tissues in vitro. MethodsFibroblast cells in SD rat Fibrous tissues were cultured in vitro, then pressure stress was conducted on these cells, and the cell cycle time and the proliferation index were detected. ResultsAfter pressure stress, the blockage of cell cycle time could be observed, the number of cells in resting phase and DNA pre-synthesis phase (G0/G1)was increased, while that of cells in mitosis prophase(S) was decreased, and the PI was also decreased. The results showed statistical differences. ConclusionPressure force modulates the cell cycle time and the PI of fibroblast cells in fibrous tissues restrainedly, which may be one of the possible cytobiological principles of that dredging the channels and eliminating stagnation submitted by massage therapy.
       Key words： Massage；  Pressure stress；  Fibrous tissues；  Fibroblast cells；  Dredging the channels and eliminating stagnation；  cell cycle time；  PI
       
       推拿按摩是医者徒手或借助一定的器具，运用自身的力量和技巧，作用于患者机体的特定部位，通过调节患者机体病理生理的变化，从而达到防治疾病目的一种中医临床常用外治疗法。《素问·血气形志篇》曰：“经络不通……治之以按摩醪药”。现代针灸推拿学研究发现：经络不通经筋“聚结”时，在阳性反应点筋膜结缔组织结构中有大量的成纤维细胞增生［1］，影响了筋膜组织的连续均匀分布，形成结节和局部压痛点。在推拿临床实践中，通常采用局部按揉的治疗手段“舒筋散结”，从而达到治疗目的。但是，推拿按摩操作究竟是如何对增生的细胞进行调控以“舒筋散结”的，其现代生物医学机理是什么，目前推拿学研究尚未见明确报道。因此，本课题以大鼠膝关节以下外侧皮下筋膜组织成纤维细胞为研究对象，采用能屏蔽体内复杂影响因素的体外细胞生物力学实验为研究手段［2，3］，观察筋膜组织成纤维细胞应力作用后细胞周期与PI的变化，探讨推拿按摩基本力学刺激形式对筋膜组织成纤维细胞生长进行调控从而“舒筋散结”的基本生物医学原理。现报道如下。
       1  材料
       1.1  材料健康3月龄雄性SD大鼠14只（四川大学实验动物中心提供，合格证号：0003085）；DMEM培养基、小牛血清、胰蛋白酶（GIBCO，USA）；CO2培养箱（Heraeus，Germany）；倒置相差显微镜及组像系统、体视显微镜（Olympus，Japan）；气压传导压力加载装置（自制）［2］，流式细胞仪（Coulter, USA）等。
       1.2  筋膜组织成纤维细胞的原代培养及传代［2，3］对SD大鼠分别进行膝关节以下外侧皮下组织块取样，体视显微镜下分离其中的筋膜结缔组织，无菌条件下剪碎组织块，移入无菌小瓶中，按酶消化法获取原代成纤维细胞，置于CO2孵箱内培养。待细胞贴壁生长后，每隔2 d换液，每日观察生长状况，细胞生长达80%融合时传代。
       2  方法
       2.1  细胞力学加载实验
       2.1.1  细胞加力前培养取第2～3代筋膜组织成纤维细胞，弃培养液，加入0.25%胰酶+0.1%EDTA混合消化液消化细胞，约3～5 min；当瓶底出现针孔样透明时，用含10%小牛血清的DMEM终止消化细胞，调整细胞密度，按2×105/ml接种于6孔培养板；显微镜下见细胞完全贴壁生长后，继续培养72 h；弃含10%小牛血清的DMEM培养液，准确更换含5%小牛血清的DMEM培养液3ml，再培养24 h，使细胞同步化，备用。
       2.1.2  实验设计及操作将实验大鼠筋膜组织成纤维细胞样本（n=14）随机分为空白对照组和压力刺激组，每组7个样本。将压力刺激组细胞置于压力装置中，然后移入37℃含5%CO2孵箱中，以孵箱内5%CO2+95%空气组成的混合气体加压，维持压力装置内的压力达100 kPa，每次加力4 h，每12 h1次，共6次；将空白对照组细胞置于37℃含5%CO2孵箱中，不施加压力刺激，于压力组实验开始时同步继续培养；实验结束后取出细胞培养板，备用。
       2.2  细胞周期和增殖指数检测采用流式细胞术进行：将实验结束后取出的细胞培养板加入0.25%胰酶消化约2 min，用含血清DMEM终止消化，收获细胞，PBS液反复洗涤、离心（1 000 r/min，8 min）3次，弃尽PBS液，加入75%乙醇1 ml制成细胞悬液，然后加入碘化丙锭染液1 ml，作用30 min后上机检测细胞周期。细胞增殖指数（Proliferative index， PI）计算：PI=S%+G2/M%G0/G1%+S%+G2/M%×100%
       2.3  统计学处理采用SPSS13.0统计软件独立样本t检验进行分析。
       3  结果
         
       筋膜组织成纤维细胞在压力刺激作用下细胞周期和PI的影响见图1～2和表1。压力作用后，压力组与空白组相比，虽然筋膜组织成纤维细胞的G2/M期细胞比例无明显变化，差异无统计学意义（P＜0.05），但是细胞周期还是发生了明显改变，G0/G1期细胞增多，S期细胞减少，差异有统计学意义（P＜0.05）；且PI也显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。表1  压力刺激对筋膜组织成纤维（略）
       4  讨论
       4.1  压力是推拿的基本力学作用形式之一［2］推拿按摩实际上是各种治疗手法的代表性总称，其对人体的治疗作用在本质上是一种机械力的刺激作用。如果按照手法作用力的维向分类，不同手法可分为一维力型手法（垂直方向发力）、二维力型手法（垂直方向+水平纵向或水平横向发力）和三维力型手法（垂直方向+水平横向+水平纵向发力）。但不论何种手法，其操作的主力方向一般只有一个或两个，而且绝大多数是垂直方向力（或包括垂直方向力）。此垂直方向力的大小即代表手法操作中“深透性”程度的大小，而“深透”是推拿按摩操作的施术原则之一，因此，垂直方向上的压力刺激是推拿最基本的力学作用形式。
       4.2  筋膜结缔组织是经筋实质的重要组成部分之一经筋理论是推拿疗法的基础，是经络系统的重要组成部分。《类经》提出经筋是“联缀百骸”“维络周身”“筋会于节”的组织，指出它是“中无有空”“各有定位”的组织。《灵枢》中的《天年》和《刺节真邪》等篇章指出“肌肉解利”是经筋的生理常态，而“聚结”“筋挛”等是经筋的病态形征表现，由此可知经筋是机体“联缀百骸”，与骨构成人体身形，缠绕关节，主司运动的组织，这部分组织的功能与现代解剖中骨骼肌及其辅助结构的功能相似，所以，现代研究认为：经筋是包括肌膜、肌腱、筋膜、韧带及关节等处的结缔组织的筋肉系统［5］。
       
       筋膜结缔组织起源于胚胎时期的间充质，其细胞组成以未分化的潜能细胞为主［6］，其中，数量最多的是成纤维细胞［2,3］，因此，探讨筋膜组织成纤维细胞应力作用后细胞周期与增殖的变化，将对揭示推拿按摩“舒筋散结”的生物医学原理奠定一定的理论基础。
       4.3  体外压力刺激对筋膜组织成纤维细胞周期和增殖的影响与推拿学意义探讨细胞周期［7］（cell cycle）是细胞生命活动的一个复杂而又与内、外环境调控因素密切相关的过程。在一般生理状态下，细胞周期分为4个活动相和1个非活动相。非活动相为G0期（休止期细胞），代表细胞处于DNA合成前的相对静止状态。当接受信号刺激后，非活动相细胞可进入活动相细胞周期，即为G1期（DNA合成前期），为DNA合成做准备。长期停滞在G1期的细胞也可称为G0期细胞。G1期和G0期的DNA同为2倍体。G1期后细胞进入S期（DNA合成期），DNA复制，细胞核增大，此期DNA为2～4倍体。然后细胞进入G2期（分裂前期），为细胞分裂做准备；最后进入M期（分裂期），将染色体等分分到两个子细胞中，细胞分裂后，M期结束。G2期和M期DNA为4倍体。随着分裂的结束，细胞可以进入G0期或者继续进入G1期开始另一个细胞周期。
       
       细胞增殖［7］（cell prolifeation）指细胞分裂和再生的过程。在生命过程中，机体细胞各组成部份在不断发展变化的基础上，大部分还要不断增殖，产生新细胞，以代替衰老、死亡和创伤所损失的细胞，这是机体新陈代谢的表现，也是机体不断生长发育、赖以生存和延续种族的基础。细胞增殖以分裂的方式进行，每次分裂后所产生的新细胞必须经过生长增大，才能再分裂，因此细胞增殖是通过细胞周期来实现的。通常情况下，如果细胞增殖低下可导致组织器官发育不全；相反，如果细胞增殖过度则可导致组织异常增生，发生病理变化，甚至发生肿瘤，严重影响机体正常生理功能。
       
       本次实验借鉴细胞生物力学的研究手段，体外培养生长旺盛的筋膜结缔组织成纤维细胞，在屏蔽了其他因素干扰的情况下，模拟推拿压力作用方式实施压力刺激［2，3］，研究证实：筋膜组织成纤维细胞压力作用后，细胞周期发生改变，G0/G1期细胞增多，S期细胞减少，PI降低，差异有统计学意义。研究认为：由于经络不通经筋“聚结”时，其阳性反应点筋膜结缔组织结构中病理反应是成纤维细胞的大量增生［1］，那么，压力刺激对生长旺盛的筋膜组织成纤维细胞周期的阻滞作用，以及对细胞增殖的抑制作用，则可能反映的是推拿按摩对结节和局部压痛点“舒筋散结”的现代细胞生物力学机制。然而，笔者同时也注意到，运用细胞生物力学的实验手段研究阐释推拿治病机理目前尚少，因此，这种机理是否成立，必须象其他细胞生物学研究一样，在整体实验中予以进一步证实，而这将有待于研究的继续深入。
       【参考文献】
         　　［1］李忠仁. 实验针灸学［M］. 北京：中国中医药出版社，2003: 85，131.
       
       ［2］陈 波，罗永芬，崔 瑾，等. 静态压力刺激对大鼠“足三里”穴区及穴旁区域成纤维细胞PGE2和IL-6释放影响的比较研究［J］.中国针灸，2007，27（2）：135.
       
       ［3］陈 波，谢西梅，贾 莹，等. 体外压力刺激对大鼠筋膜组织细胞合成释放NO和IL-1β影响的研究［J］.中华中医药杂志，2008，23(7):622.
       
       ［4］章静波. 组织和细胞培养技术［M］.北京：人民卫生出版社， 2002:127.
       
       ［5］刘 涛，李 平. 经筋实质初探［J］.中国针灸，2007，27(4):297.
       
       ［6］原 林，焦培峰，唐 雷. 中医经络理论的物质基础-结缔组织、筋膜和自监控体系［J］.中国基础科学研究论坛，2005， 3:44.
       
       ［7］宋今丹. 医学细胞分子生物学［M］.北京：人民卫生出版社，2003:356，401.