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       【摘要】 
       目的研究激素＋滋阴清热方治疗前、中、后阴虚内热证红斑狼疮（SLE）外周血单一核细胞（PBMC）凋亡相关BCL-2基因家族的动态表达。方法阴虚内热证SLE患者治疗前、中、后三次及健康对照组外周血单一核细胞基因表达谱芯片检测，对BCL-2基因家族成员数据进行分析。结果找到BCL-2基因家族基因16个，其中BCL-2、BAG3治疗前、中、后均明显下调，而BAG1、BCL6、BCLA21治疗后表达均上调。结论 阴虚内热证SLE患者PBMC存在BCL-2基因家族凋亡基因的异常，激素与滋阴清热方治疗后抑制/促进凋亡的BCL-2基因比例发生明显改变，细胞凋亡减少。BCL6可能是中医药等治疗SLE的靶基因之一。提示研究不同证型SLE治疗前后T、B淋巴细胞亚型的凋亡情况及凋亡机制，是合理评价凋亡在SLE发病及诊治中的作用的关键。凋亡基因的调控可能是滋阴清热方实现阴平阳秘的内在机制之一，有待深入研究。
       【关键词】  阴虚内热证； 系统性红斑狼疮（SLE）；BCL-2； 细胞凋亡
       The Dynamic Expression of BCL-2 Family Gene in Peripheral Blood Mononuclear Cells of SLE with Yin Asthenia Generating Intrinsic Heat
       LAI Meisheng,  FAN Ruiqiang
       1.Surgery of TCM, Southern Medical University, Guangzhou, Guangdong,510515 China；2.Dermatology of Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou, Guangdong,510120 China
       Abstract：ObjectiveTo study the dynamic expression of the apoptosis-associated BCL-2 gene family in the peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of the heat deficiency patients with lupus erythematosus (SLE) before, during and after treatment with hormone and Ziyin Qingre formula. MethodsBefore, during and after treatment, peripheral blood mononuclear cells of the SLE patients with “Yin” asthenia generating intrinsic heat were separated,then cDNA microarray chip was used to analyze and compard with a healthy control group,in this part, the data of BCL-2 gene family members were selected out and analyzed.Results16 BCL-2 family gene were found. The expression of BCL-2 and BAG3 were significantly reduced before, during and after treatment, while the expression of BAG1, BCL6 and BCLA21 was increased after treatment.ConclusionAbnormalities of BCL-2 family gene in PBMC of SLE patients with “Yin” deficiency heat were observed. Apoptosis suppression and promotion gene of BCL-2 family were changed by the hormones and Ziyin Qingre formula treatment which led to reducing apoptosis. BCL6 may be one of the target gene which was affected by the treatment of Chinese medicine. To study the different subtypes apoptosis and apoptosis mechanisms of T and B lymphocyte of SLE with different syndrome pattern before and after treatment is very important for  estimation on the role of apoptosis in SLE pathogenesis, diagnosis and treatment. Regulation of apoptotic genes may be one of the mechanisms of Ziyin Qingre formula to achieve "Yin" and "Yang" in a relative equilibrium.
       Key words："Yin" asthenia generating intrinsic heat;   Systematic lupus erythematosus (SLE);   BCL-2;   Apoptosis
       
       SLE是多基因相关的自身免疫性系统性疾病，发病与细胞异常凋亡密切相关。BCL-2/Bax是诱导细胞凋亡的通路之一。Bax是BCL-2癌基因家族中能够促进细胞凋亡的蛋白，BCL-2是能够抑制细胞凋亡的蛋白，两者的比值决定细胞凋亡与否，当Bax多时，细胞凋亡，否则凋亡延缓［1］。BCL基因家族中其它基因也与细胞凋亡密切相关。阴虚内热证是SLE的最常见最基本的证型。广东省中医院皮肤科多年应用滋阴清热方治疗阴虚内热证SLE取得良好效果，我们研究阴虚内热证SLE中医药治疗后BCL基因家族表达的动态变化，试图从基因水平探讨其现代分子机制。
       1  临床资料
        轻中度（5≤SLEDAI≤25）阴虚内热证SLE患者从2005-11～2006-11在广东省中医院门诊就诊的女性患者（年龄在18～50岁之间）中纳入，总共纳入18例，其中退出2例，失访1例，有效病例共15例。健康对照组来自于健康志愿者，共15例。阴虚内热证SLE患者15例，最大48岁，最小18岁，平均年龄：（31.60±9.37）；健康对照组15例，均为女性，最大42岁，最小18岁，平均年龄：（28.4±6.50）。两组年龄经两样本t检验，方差齐性（F＝2.929，P＝0.098），差异无统计学意义（t=1.087，P=0.289）。纳入、排除、剔除、退出标准详见赖梅生博士论文［2］。
       2   研究方法
       2.1   治疗方法
       2.1.1  中药治疗滋阴清热方(狼疮Ⅱ号)，5粒/次，3次/d口服。 部分病人阴虚内热症候比较明显时，短期配合使用滋阴清热方汤剂，加强滋阴清热功效。
       2.1.2  一般治疗及对症处理保护胃粘膜、补钾、补钙、抗感染。西医药除激素外，只根据患者激素用量配合使用泰胃美、雷尼替丁保护胃粘膜。
       2.1.3  激素治疗所有病例均维持纳入时的激素用量，最高不超过25mg。疗程3个月。
       2.2  表达谱基因芯片实验方法分别于治疗前、治疗中（6周）和治疗后（12周）采静脉血分离提取淋巴细胞，然后按基因芯片技术要求提取总RNA，－70℃保存备用，按完成3个月疗程的先后顺序送检9例患者的27个样本和10例正常人样本，其中4例患者至少有一次样本不符合基因芯片实验要求，最后选择了3次样本均合格的5例患者的15个样本及正常对照组10个样本，首先对样品进行体外扩增处理，随后对扩增后的RNA样品采用反转录标记方法掺入CY3荧光分子，每个样品完成一张GS芯片（人类基因表达谱芯片由微芯生物公司采用cDNA直接点样生产，共点有8 064个基因点，其中7 458个为表达基因片段）实验。
       2.3  数据处理与统计分析比值（Ratio）表示荧光信号通过LOWESS方法归一化后，基因表达量在实验组（对照组）和对照组（实验组）间的变化倍数（大于1的数值代表相应基因表达量上调的倍数，小于1的数值则代表相应基因表达量下调，其倍数则用1除以该数值后的负数来表示）。按两个样品信号强度间的比值（Ratio）大于2或小于0.5的数据作为表达有显著性差异的基因数据。用SPSS13.0软件将16个BCL基因家族成员基因前、中、后3次表达与正常人的表达的比值（Ratio）进行重复测量方差分析和多元方差分析，两两比较用SNK法。
       3  结果
        BCL基因家族与细胞凋亡等密切相关，我们对16个BCL相关基因进行分析，总体3次表达无差异（P=0.560），而不同基因间有显著性差异（P=0.000），测量时间与不同基因间存在交互作用（P=0.014），说明不同基因在不同时间有差异表达。从图1可以看到BCL2、BAG3治疗前、中、后均明显下调，而BAG1、BCL6、BCLA21治疗后表达均上调，两类基因间表达有统计学差异（P<0.05），但同一基因间两两比较差异无统计学意义（P>0.05），与孙保东等［3］的研究类似。
       4 讨论
         
       细胞凋亡与SLE发病密切相关，细胞凋亡在SLE发病中的作用研究观点不一，淋巴细胞异常凋亡导致自身抗原的产生或者细胞凋亡可清除自身反应性细胞的观点不一。本研究中发现许多凋亡相关基因表达与正常人有差异，治疗前后都有抗凋亡与促凋亡基因表达的上调或下调。BCL-2基因家族在凋亡的调控中有重要作用，其中抗凋亡的有：BCL-2，A1，BCL-xl，BCL-w，Mcl-1，促进凋亡的有Bax，Bak，Bad，Bid，Bim，Bik，BNIP3［4］。研究证实BCL-2通过与Bax结合抑制凋亡,Bad通过与Bcl-2的结合置换Bax, bax/BCL-2比例可调控凋亡的发生：BCL-2水平高于Bax时，细胞对凋亡不敏感，反之细胞易于凋亡。Bax在健康细胞中以单体形式存在于细胞质内，当受到相关的凋亡信号刺激时会转移到线粒体上，直接或间接地与线粒体通道蛋白作用，引起细胞色素C的释放。Bad的BH3域可以与BCL-2家族在线粒外膜结合而使之灭活，从而促进凋亡的发生。我们的研究发现抑制凋亡的BCL-2基因表达水平治疗前、中、后均显著低于正常人的表达，而BAG1基因也是抗凋亡基因，治疗前接近正常人，治疗3个月后升高，BCL2A1也是抗凋亡基因，治疗后显著升高。而促进细胞凋亡的基因BAX、BAK1治疗前高于正常人，治疗后接近正常人。可见治疗前BCl-2/Bax比值显著低于正常，提示SLE通过BCL-2/Bax细胞凋亡途径促进外周单一核细胞的凋亡，与张丽霞［5］的研究发现相一致。治疗后BCL-2/Bax升高，提示治疗后外周单一核细胞的凋亡减少，与温成平等观察到解毒祛瘀滋阴药治疗后的BCL-2/Bax比值升高相一致［6］。
       
       原癌基因BCL6编码一种DNA结合蛋白，为一核转录因子，其功能是调节淋巴结生发中中心B细胞的分化与发育成熟，生发中心B细胞表达BCL6，离开生发中心后停止表达。BCL6可抑制P53在生发中心B淋巴细胞的组成型表达而保护因DNA损害诱导的凋亡［7］。有研究认为，缺乏BCL6表达的B细胞虽可以在脾脏中分化成IgM和IgG1记忆B细胞，但很少在骨髓中分化成长寿的能分泌IgG1抗体的B细胞［8］。BCL6治疗3个月后表达显著上调，提示治疗后B细胞较多从淋巴结生发中心释放到外周血中，这可能与治疗后外周异常克隆B淋巴细胞被清除，而生发中心的正常B淋巴细胞因BCL6表达的提高而凋亡减少且分化发育成熟加快，从而转移到外周血中以发挥正常的功能。提示BCL6可能是中医药等治疗SLE的靶基因之一，有待进一步深入研究。
       众多研究发现SLE患者常常同时有抑制凋亡和促进凋亡的基因的表达上调或下调，治疗前细胞凋亡增多，为什么反而有大量异常B淋巴细胞克隆增殖，产生大量自身抗体，而治疗后，外周单一核细胞凋亡减少，而不是促进异常B淋巴细胞的凋亡，令人费解。对于这一困境的思索，我们认为很可能不同类型的T、B淋巴细胞在SLE发病的不同阶段、治疗前后其凋亡率有很大的差异，这种差异可能来自不同细胞的凋亡机制存在差异，这与从这些看似矛盾的研究结果来看，可能并不矛盾，而是我们对细胞凋亡的机制研究仍不够深入。SLE外周血淋巴细胞抗凋亡的基因表达降低而促进凋亡的基因表达增加，促进淋巴细胞的异常凋亡，进而释放更多的自身抗原入血，驱动B细胞产生自身抗体。治疗后BCL相关基因家族中抗细胞凋亡基因上调与促凋亡基因下调，外周单一核细胞凋亡减少，可能与治疗后异常T、B淋巴细胞已被渐渐清除，正常B细胞较多从淋巴结生发中心释放到外周血中，且正常T、B淋巴细胞的凋亡减少。
         
       我们认为，分析研究不同证型SLE治疗前后T、B淋巴细胞亚型的凋亡情况及凋亡机制，是合理评价凋亡在SLE发病及诊治中的作用的关键。中医药治疗似乎在调节细胞凋亡方面有着独特的作用，可以使各种细胞的凋亡达到新的平衡，这也许是中医辨治达到阴平阳秘的现代机理之一。
       【参考文献】
         　　［1］Tao XJ, Tilly KI, Maravei DV, et al. Differential expression of members of the bcl-2 gene family in proliferative and secretory human endometrium: glandular epithelial cell apoptosis is associated with increased expression of bax［J］.J Clin Endocrinol Metab,1997,82:2738.
       
       ［2］赖梅生．滋阴清热方对阴虚内热证SLE淋巴细胞基因及蛋白表达谱的动态影响［D］．广州中医药大学博士学位论文，2007：6.
       
       ［3］孙保东，沈 南，裴 军，等．SLE病人外周血白细胞Bcl22和Bcl2XmRNA表达研究［J］．上海免疫学杂志，2000，20（4）：239.
       
       ［4］周桔，罗荣保，汤长发，等．Bcl-2蛋白家族和p53基因在细胞凋亡中的调控效应［J］．中国组织工程研究与临床康复，2007，11（10）：1950.
       
       ［5］张丽霞，郑 京，洪江淮．热毒炽盛型SLE与肾小球Fas、BcL-2、Bax蛋白表达［J］．中医药学刊，2003，21(9):1518.
       
       ［6］温成平，曹灵勇，王新昌，等．解毒祛瘀滋阴药对SLE患者Bax/Bcl22基因mRNA表达的影响［J］．浙江中西医结合杂志，2007，17（6）：333.
       
       ［7］Fabrice Jardin, Philippe Ruminy, Christian Bastard et al．The BCL6 proto-oncogene: a leading role during germinal center development and lymphomagenesis［J］.Pathologie Biologie, 2007，55（1）：73.
       
       ［8］Toyama H, Okada S, Hatano M, et al. Memory B cells without somatic hypermutation are generated from Bcl6-deficient B cells［J］. Immunity，2002，17(3):329.