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       【摘要】 
       目的观察补肾调周法对造模大鼠性激素和胰岛素样生长因子-1（IGF-1）的影响。方法将60只大鼠随机分为6组，即空白组，模型组，补肾调周低、中、高剂量组，阳性对照组，每组各10只。除空白组外其余各组采用HCG+胰岛素(INS)建立多囊卵巢（Polycystic Ovary，PCO）动物模型。补肾调周法序贯治疗16 d后测定血清T、LH、E2、INS含量，免疫组化法检测胰岛素样生长因子-1（IGF-1）在卵巢组织的表达，并在光镜下观察卵巢组织形态。结果补肾调周法能显著降低PCO模型大鼠血清T，LH，E2，INS含量，减少IGF-1在卵巢组织的表达，增加卵巢颗粒细胞层数，增加黄体组织数量。结论补肾调周法可改善多囊卵巢综合征高胰岛素血症和高雄激素血症，且具有多途径、多环节、多靶点的特点。
       【关键词】  多囊卵巢综合征　高雄激素血症　高胰岛素血症　补肾调周法　 胰岛素样生长因子
       Effects of Method of Invigorating Kidney and Regulating Menstruation on Sex Hormone and Insulin-like Growth Factor-1 Levels in Rats with Polycystic Ovary
       LI Cuiping, HUANG Xia,CHEN Yang,FAN Xiaoli ,SUN Wei,LIU Huixia
       1.The Third Hospital of Henan University of TCM, Zhengzhou 450008, China;2. Henan Institute of TCM, Zhengzhou 450004, China;3. Postgraduates 2007 Henan University of TCM , Zhengzhou 450008, China
       Abstract：ObjectiveTo observe the effects of method of invigorating kidney and regulating menstruation on sex hormone and insulin-like growth factor-1（IGF-1） levels in rats with polycystic ovary. Methods60 rats were randomly divided into 6 groups (n=10): blank group, model group,  low dose of invigorating kidney group, middle dose of invigorating kidney group, high dose of invigorating kidney group, masculine control group. In addition to the blank group, the other groups were induced as PCO model by insulin and HCG.After 16 days  treatment with the method of invigorating kidney and regulating menstruation,the serum levels of testosterone (T), luteinizing hormonl (LH), estradiol(E2) and insulin(INS) were determined,the expression of IGF-1 in the ovary was detected with immunohistochemical method, and organization shape of owary was observed under the light microscope. ResultsThe method of invigorating kidney and regulating menstruation could obviously reduce the serum levels of T, LH, E2, and  INS content in PCO model rats, inhibit the expression of IGF-1 in the ovary and increase the granular cell layer and the quantity of the yellow body organization of ovary.Conclusion The method of invigorating kidney and regulating menstruation may improve the hyperinsulinemia and hyperandrogenism of PCOS with the characteristics of multi-ways, multi-links and the multi-target.
       Key words：Polycystic Ovary Syndrome(PCOS);   Hyperandrogenism;   Hyperinsulinemia;   Method of invigorating kidney and regulating menstruation;   IGF-1
       
       多囊卵巢综合征 (Polycystic Ovary Syndrome ,PCOS)是育龄期妇女常见的一种极为复杂的由神经、内分泌及代谢系统和卵巢局部的调控因素失衡引起的病理状态，发病率为5%～10%［1］，以高雄激素血症、持续无排卵、胰岛素抵抗和高胰岛素血症为主要临床特征。胰岛素（INS）和胰岛素样生长因子-1（IGF-1）参与卵巢功能的调节，是引起多囊卵巢综合征的重要病因学因素。本实验通过观察补肾调周法对造模大鼠血清睾酮（T）、黄体生成素（LH）、雌二醇（E2）、胰岛素（INS）含量以及胰岛素样生长因子-1（IGF-1）在卵巢组织表达的影响，探讨补肾调周法改善高胰岛素血症及高雄激素血症的具体作用机制，为补肾调周法治疗多囊卵巢综合征的临床应用提供可靠的理论依据。
       1  材料
       1.1  动物Wistar大鼠，60只，雌性，60 d龄，体质量（160±10）g，由河南省实验动物中心提供。随机分为6组：空白组、模型组、补肾调周低剂量组、补肾调周中剂量组、补肾调周高剂量组、阳性对照组，每组10只，分笼喂养。
       1.2  药物与试剂补肾Ⅰ号方：当归15 g，川芎10 g，白芍15 g，熟地15 g，淫羊藿30 g，紫石英30 g，黄精30 g，女贞子30 g，香附10 g，甘草6 g。加水煎煮，浓缩为每毫升含生药2.7 g；补肾Ⅱ号方：菟丝子 30 g，续断30g，桑寄生15 g，何首乌15 g，炒杜仲10 g，山药15 g，黄精30 g，淫羊藿30 g，木香6 g，甘草3 g。加水煎煮，浓缩为每毫升含生药2.2 g。药物均购于河南中医学院第三附属医院中药房，由河南中医学院药理实验室制备，批号：20081013。注射用绒促性素（HCG）粉针剂：丽珠集团丽珠制药厂，2 000单位/支，批号：080702A。精蛋白生物合成人胰岛素注射液（诺和灵N）：丹麦诺和诺德公司，每支400单位/10 μl，1支/盒，批号：VVG0038。二甲双胍：上海医药集团有限公司信谊制药总厂，批号：080508A。T、LH、E2放射免疫分析测定盒：深圳拉尔文生物工程技术有限公司，批号均为20090101。IGF-1单克隆抗体：博士德生物工程有限公司，0.2 ml，200 μg/ml，批号：BA1235。免疫组化SP试剂盒：天津博美科生物技术有限公司，批号：20081104。
       2  方法
       2.1  建立动物模型参照Poretsky L［2］造模方法加以改良，除空白组外均皮下注射HCG 3.0 IU,2次/d,共9 d;INS于第1～11天内自0.5 IU/d开始,逐渐递增至6.0 IU/d,自第12天起按6.0 IU/d维持至第22天，建立INS+HCG诱导的大鼠PCO模型。第23日阴道开口,连续阴道上皮细胞涂片两个性周期(每个性周期4d),阴道上皮细胞持续角化,提示无排卵大鼠模型制作成功。造模期间除空白组外的其余各组均以浓度为5%的葡萄糖溶液作为日常饮用水，预防低血糖休克的发生。空白组大鼠同期皮下注射同体积生理盐水。
       2.2  给药方法模拟大鼠性周期，第1～2天给予补肾调周Ⅰ号方灌胃［低：32 g/（kg·d），中：48 g/（kg·d），高：64 g/（kg·d）］，第3～4天给予补肾调周Ⅱ号方灌胃［低：31 g/（kg·d），中：46 g/（kg·d），高：61 g/（kg·d）］。阳性对照组每天等容灌胃二甲双胍［0.38 g/（kg·d）］混悬液。空白组及模型组等容灌胃蒸馏水。连续给药16 d(4个性周期)。
       2.3  观察指标末次给药后，各组大鼠禁食12 h，不禁水，用电子天平称重后，断头取血5 ml，将所取血静置30 min，2 000 r/min，离心10 min，取血清，放射免疫法测定血清T、LH、E2的含量；发光化学免疫法测定血清胰岛素的含量。解剖双侧卵巢组织,吸去血迹,除去表面脂肪组织,称重，用10%的中性甲醛固定，常规石蜡切片,作HE染色，行组织病理学检查；常规切片，经过脱蜡、抗原修复、SP染色、显色等，免疫组化法测定卵巢组织IGF-1表达水平（以胞浆内出现棕褐色着色为阳性判断标准），用Leica图像分析系统每张切片100×下选取5个视野，分析每个视野阳性细胞所占镜下细胞面积百分比，取均值。
       2.4  统计学处理统计学采用SPSS13.0 软件进行处理，计量资料所有数据用±s表示，单因素方差分析，P<0.05有显著统计学意义。
       3  结果
       3.1  血清学变化与空白组比较，模型组血清T，LH，E2，INS明显升高，差异有显著统计学意义（P<0.05），说明模型复制成功。与模型组比较，补肾调周低、中、高剂量组及阳性对照组T、LH、E2、INS均有所降低，差异有显著统计学意义（P<0.05）。结果见表1。
       3.2  卵巢组织IGF-1表达的变化与空白组相比，模型组、低、中、高剂量组IGF-1表达均有不同程度增强，差异有显著统计学意义（P<0.05）；与模型组相比，低、中、高剂量组及阳性对照组IGF-1表达均有所减弱，差异有显著统计学意义（P<0.05）。见表1。表1  各组大鼠性激素、胰岛素及卵巢胰岛素样生长因子-1表达的比较（略）
       3.3  病理组织学观察空白组可见各个发育阶段的卵泡及多个黄体组织，卵泡内颗粒细胞层排列整齐，可见颗粒细胞层数较多（10～15层）的次级卵泡，卵泡内卵丘、卵母细胞清晰可见；模型组可见闭锁卵泡及大量呈囊性扩张的卵泡，颗粒细胞层排列不规则且松散，颗粒细胞层数明显减少（仅2～3层），黄体组织少见；补肾调周高、中、低剂量组均可见到各个发育阶段的卵泡及较多黄体组织，卵泡内颗粒细胞层数（8～10层）较模型组明显增多，排列整齐，可见卵丘及卵母细胞，闭锁卵泡少见；高剂量组颗粒细胞层数及黄体组织数量较低、中剂量组增多；阳性对照组与模型组相比，颗粒细胞层数较多的次级卵泡及黄体组织数目均较模型组明显增多，但都少于高、中、低剂量组。
       4  讨论
        《傅青主女科》谓“经水出诸肾”，肾在月经的产生中起着主导和决定作用。肾藏精气，为天癸之源，冲任之本。《妇人大全良方》云：“肾气全盛，冲任疏通，经血既盈，应时而下，否则不通也。”肾藏精，精能化血，血能生精，精血同源而互相资生，成为月经的物质基础。肾气盛，促使天癸成熟，任通冲盛，血海按时满溢于胞宫，月事以时下。若肾精不足，元阴亏虚，冲任气血乏源，无以下注胞宫，则表现为经水后期或闭经。在月经的产生机理中，肾为主导，肾气、天癸共同主宰，通过冲任二脉的通盛，相资为用，由胞宫具体体现其生殖生理功能。祖国医学无多囊卵巢综合征记载，据其症状，可归属于中医“月经后期”“月经量少”“闭经”“崩漏”“不孕”等疾病范畴。中医认为，本病是由肾-天癸-冲任-胞宫之间平衡失调所致，肾虚为基本病机，应将补肾贯穿于PCOS治疗的始终。《血证论》指出：“月有盈亏，海有潮汐。女子之血，除旧生新，是满则溢，盈必亏之道。”月经出现周期性的藏泻，是肾阴、肾阳转化，气血盈亏变化的结果。经后期，血海精血耗损，血海相对空虚，冲任暂时不足，肾阴增长，阴中有阳；经间期，天癸真阴渐盛，重阴转阳，阴盛阳动；经前期，天癸充而冲任盛，肾阳逐渐旺盛，阳长阴消。补肾调周法即是依据中医妇科学的基础理论，采用以补肾为主，结合月经周期不同阶段肾的阴阳转化、消长节律和气血盈亏变化规律，给予周期性用药，调整脏腑气血阴阳动态平衡的一种疗法。其根据女性生理周期变化采用补肾调周系列方（补肾Ⅰ号方、补肾Ⅱ号方）序贯治疗，补肾填精，通调冲任，平衡阴阳。不仅体现了现代医学崇尚自然疗法的特点，而且把中医学的整体观、天人相应观应用于临床，更能体现因人、因时、因地制宜。
        补肾Ⅰ号方滋阴补肾，养血行气，用于调整月经过后阴血亏虚，冲任不足的状态，以候氤氲之期。以熟地、黄精滋肾益精，填补真阴为君；女贞子、白芍、当归共起滋阴养肝，补血活血之功；淫羊藿、紫石英偏于补阳，“水为造化之原，火为万物之先”，所以养精血之中，助以温润之药，含有冲和之气，寓有生发之机，与女贞子、白芍、当归共为臣药。川芎活血行气；香附长于疏肝理气，使补血而不滞血，充盛之中兼有疏通之机，两者共为佐药。使以甘草，调和药性。诸药合用，共奏滋阴补肾，养血行气之效。补肾Ⅱ号方温补肾阳，健脾行气。菟丝子、淫羊藿温阳补肾，调理任督共为君药。桑寄生、续断、炒杜仲长于温补肝肾、壮阳益精；何首乌补肝肾、益精血；黄精滋阴益肾，取“阴中求阳”之义，共为臣药。山药健脾益气，助生化之源；木香乃三焦气分之药，升降诸气，两者共为佐药。甘草调和诸药而为使。诸药相伍，温补肾阳，健脾行气。现代药理研究表明补肾中药不仅可通过调节下丘脑-垂体-卵巢轴来调整卵巢性激素的合成和分泌，还能够直接作用于卵巢，降低卵巢局部病理因素的表达，改善胰岛素抵抗。熟地、黄精、山药可改善胰岛素抵抗，增强代谢，降血脂，降血糖；女贞子、淫羊藿、桑寄生可调节内分泌，降血脂，抗动脉硬化，降血糖；紫石英对卵巢有兴奋作用；香附、川芎可降血压，调整免疫；菟丝子有性激素样作用，兴奋子宫使子宫增重，降血压；杜仲具有性激素和促性腺激素样作用，促进性腺发育。
       
       高胰岛素血症和高雄激素血症在PCOS病理改变中发挥着重要作用。高胰岛素可促进卵巢间质细胞合成IGF-1增多, 从而增加卵泡膜间质细胞的LH受体和雄激素的生成［3］ 。而PCOS患者的雌激素合成亢进,使垂体对下丘脑分泌的GnRH敏感性增强, GnRH脉冲分泌频率及振幅也增加,LH分泌亦随之增多［4］。增多的LH在高胰岛素的作用下进一步放大，使颗粒细胞过早进入分化状态，导致卵泡的颗粒细胞增殖终止，不能发生排卵［5］。因此，降低IGF-1在卵巢组织表达水平及血清胰岛素含量,是开辟治疗PCOS新的有效途径。本实验结果表明，运用补肾调周法能明显减少模型大鼠血清T、LH、E2、INS的含量及胰岛素样生长因子-1在卵巢组织的表达，改善造模大鼠卵巢形态学的病理变化。补肾调周法一方面可通过降低血清中INS的含量使模型大鼠卵巢间质细胞合成IGF-1减少,从而阻断雄激素合成增加的途径，降低血清雄激素水平，促使卵巢功能恢复，产生排卵；另一方面可通过改善PCOS雌激素和LH合成亢进，来诱导排卵。本研究认为补肾调周法可在整体（神经、内分泌及代谢系统）和局部（卵巢）均发挥调节作用，改善PCOS高胰岛素血症和高雄激素血症，具有多途径、多环节、多靶点的特点。
       【参考文献】
         　　［1］DiamantiK E,Kouli C R,Bergiele A T,etal.A survey of the polycystic ovary syndrome in the Greek is land of Lesbos:hormonal and metabolic profile［J］.J Clin Endocrinol Metab1999,84:4006.
       
       ［2］Poretsky L,Clemons J,Bogovich K.Hyperinsulinemia and human chorionec gonadotropin synergistically promote the growth of ovarianfollichlar cysts in rats［J］.Metabolism.1992,41(8):903.
       
       ［3］范海健,王 勇.胰岛素样生长因子系统的研究进展［J］.医学研究生学报,2005,18(8):746.
       
       ［4］曹泽毅.中华妇产科学［M］.北京:人民卫生出版社,1999：2180.
       
       ［5］李美芝.妇科内分泌学［M］.北京：人民军医出版社,2001:212.