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       【摘要】 
       目的研究大蓟总黄酮对肿瘤细胞凋亡的影响。方法用不同浓度的大蓟总黄酮对人肝癌SMMC-7721和人子宫癌细胞Hela进行处理，MTT法检测细胞活性，再用琼脂糖凝胶电泳观察DNA“梯子”(Ladder)和DAPI染色观察凋亡小体。结果大蓟总黄酮对SMMC-7721的半数致死量(IC50)为93.64 μg/ml；对Hela细胞的半数致死量(IC50)为85.1 2 μg/ml。可见清晰的“梯子”状DNA带纹和凋亡小体。结论大蓟总黄酮能诱导癌细胞的凋亡，从而达到抗肿瘤的作用。
       【关键词】  大蓟　总黄酮　抗肿瘤　细胞凋亡　
        大蓟为菊科管状花亚科菜蓟族蓟属植物Cirsium japonicum DC. 的干燥地上部分或根［1］，多年生草本，高100～150 cm，茎直立，密被白毛，叶互生；叶片倒卵状长椭圆形，边缘具浅裂和斜刺，被毛；5～6月开花，头状花序顶生，花单生，紫红色，瘦果扁椭圆形，生于山野路边，以全草和根入药，我国大部分地区有分布。全草灰绿色，大蓟性凉，味甘、苦,归心、肝经，功效为凉血止血、祛瘀止痛，主治吐血、衄血、尿血、血淋、血崩、带下、肠风、肠痈、痈疡肿毒、疔疮、高血压及肝炎等。其化学成分复杂，主要含有黄酮、黄酮苷，挥发油、三萜和甾醇等物质。大蓟在民间验方多用于治疗癌症，如：大蓟根、三白草根治肝癌；鲜大蓟叶与鸡蛋清搅拌后贴于患处，可治乳腺癌等。大蓟的主要成分为黄酮类化合物，文献报道其多聚乙炔具有抗肿瘤作用［2］。其总黄酮在体内有抗肿瘤作用并能提高肿瘤小鼠的免疫功能［3］。但总黄酮对肿瘤细胞诱导凋亡的作用还没有研究，本文就其对肿瘤细胞诱导凋亡的作用进行初步探索。
       1  材料与仪器
       1.1  瘤株SMMC-7721和Hela细胞株，购自上海细胞生物学研究所。药物：大蓟由成都中药材公司提供。
       1.2  试剂RPMI 1640培养基、胎牛血清(FBS)为GIBCO公司产品，染料碘化丙啶(PI)、胰蛋白酶均为Sigma公司产品，四甲基偶氮唑蓝(MTT)购自上海普飞生物技术有限公司。
       1.3  仪器酶标仪（Bio-Rad，Model 3550），离心机（北京医用离心机厂，LDZ5-2），倒置显微镜（Nikon DEAPHOT Fx-35DX）。
       1.4  大蓟总黄酮的制备大蓟总黄酮由本室制备。将大蓟70%乙醇提取物与硅藻土拌样挥干后,装入玻璃管柱中,用石油醚流洗,去除其中的叶绿素和极性较小的成分;流洗结束后倒出硅藻土化合物,挥干溶剂重新装入玻璃管柱,正丁醇流洗提取,用1%三氯化铝乙醇溶液与黄酮类化合物在滤纸上显色后，在紫外灯下观察有无黄绿色荧光的方法检测监控,提取至流洗液无黄酮反应时结束;将正丁醇提取液浓缩后挥干溶剂,用少量95%的乙醇溶解后上聚酰胺树脂柱,依次用水和95%的乙醇洗脱,收集95%的乙醇洗脱液,洗脱至检测无黄酮反应时结束;浓缩95%的乙醇洗脱液,自然干燥,挥干溶剂后得到的成分即为总黄酮成分。紫外分光光度测定其总黄酮为98.52%。总黄酮用DMSO溶解。
       2  方法
       2.1  MTT法检测药物对肿瘤细胞增殖的作用SMMC-7721和Hela细胞株用0.25%胰蛋白酶化后，悬浮于含5%小牛血清的RPMI1640培养液中，用玻璃滴管轻轻吹打成单细胞悬液。取少许细胞悬液于血细胞计数板计数，活细胞数大97%，将细胞株悬液接种于96孔培养板,每孔190 μl(含1 ×104个细胞),24 h后，分别加入阴性对照磷酸盐缓冲液(PBS)、阳性对照（5-Fu）以及12.5～200 μg /mg不同浓度的大蓟黄酮提取液各10 μl,3复孔，置于饱和湿度、37℃、5%CO2培养箱中培养72 h,然后每孔加入10 μl 5 mg/ml的MTT溶液（用生理盐水配制）继续培养4 h，仔细吸去上清液，每孔加入二甲基亚砜150 μl。1 h后，在570 nm波长处用酶标仪测OD值。重复3次并计算抑制率。抑制率(IC)=(对照组OD值-实验组OD值)/ 对照组OD值× 100%。
       2.2  DAPI染色的染色体DNA的形态分别收集大蓟总黄酮处理细胞和未用药的细胞用定色剂（甲醇∶乙酸为3∶1）染色10 min，10 min后用PBS冲洗，细胞再用DAPI液（1 μg溶解在1ml PBS中），然后用固定液固定，染色体DNA的形态在荧光显微镜下观察。
       2．3  DNA琼脂糖凝胶电泳分别收集大蓟总黄酮和顺铂处理细胞1×105 个，按酚、氯仿、异戊醇抽提，乙醇沉淀等常规方法提取细胞总DNA，2％琼脂糖凝胶电泳，紫外透射仪上观察DNA条带。
       3  结果
       3.1  MTT法测试结果用剂量12.5～200 μg /mg的大蓟总黄酮处理SMMC-7721和Hela细胞48h后，MTT法测定大蓟黄酮对癌细胞的抑制作用（见图1）。从图1可以看到，对SMMC-7721和Hela细胞的IC50分别为93.64 μg/ml和85.12 μg/ml，同空白对照组比较差异极显著（P<0.01）。当用剂量12.5～200 μg /mg的大蓟黄酮处理SMMC-7721和Hela细胞1，2 d或3 d后，对肿瘤细胞的生长（见图2），从图2可以看到，活细胞数随着大蓟黄酮浓度的增加而减少。研究结果表明大蓟黄酮对SMMC-7721和Hela细胞的抑制呈剂量和时间依赖性。用大蓟黄酮处理时间越长或剂量越大，对肿瘤细胞的抑制效果就越明显。
       3.2  琼脂糖凝胶电泳结果琼脂糖凝胶电泳结果见图3，从 DNA电泳图（图3）上可以看到，癌细胞经100 μl/ml的大蓟总黄酮处理培养72h后，出现大小约为180～200 bp 整数倍的 DNA梯形断裂条带，而空白对照组细胞DNA提取物经琼脂糖凝胶电泳后只检测到一条总DNA条带。Hela细胞用100 μl/ml的大蓟黄酮处理培养72h后，出现大小约为180～200 bp 整数倍的 DNA梯形断裂条带(图3-A)。lane 3 为阳性对照（Hela 细胞用 0.1 μM taxol处理 4 h (图3-A)。图3大蓟总黄酮对SMMC 的电泳图。癌细胞经100 μl/ml的大蓟总黄酮处理培养72 h后，同样出现大小约为180-200 bp 整数倍的 DNA梯形断裂条带(图3-B， lane 4).研究结果表明大蓟黄酮能诱导SMMC-7721和Hela细胞凋亡。
       3.3  DAPI 染色观察肿瘤细胞凋亡的特征凋亡的另一个特征是用DAPI 染色观察染色体DNA 的形态， 图 4(A) 为未处理的Hela细胞 染色体DNA，图4(B)是用大蓟总黄酮100 μl/ml处理 24 h后的Hela细胞 染色体DNA。Hela细胞在空白对照中出现分散的染色体DNA，图3(A)，而用药物处理后Hela细胞的染色体DNA明显的随处理时间而改变，24 h 后, 染色体 DNA 在核膜附近浓缩成一个或几个明显的小体，图4(B)。图4(C～D) 为处理和未被处理的SMMC细胞染色体DNA 形态的变化，其凋亡特征也能观察到。
       4  讨论
        细胞凋亡是人体保持某一细胞群生存与死亡平衡的生理机制。它参与调节机体的发育、细胞的分化,体内正常细胞的更新和异常细胞的清除。普遍认为它与分裂、细胞分化类似，是一个级连式(Cascade)基因表达的结果,受许多因素的调控［4］。如果这一调控发生异常则会导致包括肿瘤、自身免疫病、神经系统疾病以及AIDS等许多疾病的发生。细胞凋亡的典型特征是:细胞凋亡过程中,被激活的核酸内切酶可有规律地将凋亡细胞DNA在两核小体间切断, DNA凝胶电泳时形成了特征性的DNA阶梯。形态上则表现为染色质固缩为不均一点状结构。细胞凋亡的另一显著特征是凋亡过程中交联细胞蛋白酶(transglutaminant)等的信号途径被激活,致使细胞浆浓缩形成的具有完整细胞膜包裹的凋亡小体(Apobody),电镜下,表现为凋亡发生早期,凋亡小体内含有正常形态的线粒体等细胞器［5］。
        大蓟总黄酮能诱导人肝癌SMMC-7721细胞和人子宫癌Hela细胞的凋亡，通过MTT法检测，其对Hela细胞的IC50为85.12 μg/ml，对SMMC-7721细胞的IC50为93.64μg/ml。大蓟总黄酮诱导细胞凋亡，DAPI染色，显微镜下观察细胞核呈致密浓染的快状或颗粒状，与凋亡形态学改变相对应的生化学基础是细胞核小体连接处DNA被随机切成180～200 bp左右及其倍数的寡核苷片段，琼脂糖凝胶电泳可见典型的“梯形”带，大蓟总黄酮处理SMMC-7721和Hela细胞后，相差显微镜下观察，细胞体积缩小，核裂解，细胞出泡，形成凋亡小体（图4），细胞贴壁能力下降，逐渐从培养瓶壁上脱落下来，DAPI染色，显微镜下观察细胞核呈致密浓染的快状，DNA电泳可见典型的“梯形”带（图3 A、B）。说明SMMC-7721和Hela细胞经大蓟总黄酮处理后发生了凋亡特征性改变。
       【参考文献】
         　　［1］国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京:化学工业出版社,2004：18.
       
       ［2］Mitsuo Miyazawa,ChikakoYamafuji, Kohsuke Kurose，et al. Volatile components of the rhizomes of Cirsium japonicum DC［J］. Flavour Fragr 2003，18（1）:15.
       
       ［3］Sujun Liu, Xun Luo, Daxu Li, et al. Tumor inhibition and improved immunity in mice treated with flavone from Cirsium japonicum DC［J］.International Immunopharmacology，2006, 6（9）：1387.
       
       ［4］Khor TO，Gul YA，Ithnin H，et a1．Positive correlation between overexpression of phopho-BAD with phosphorylated AKt at serine 473 but not threonine 308 in eoloreetal carcinoma［J］．Cancer Lett，2004，210(2)：139.
       
       ［5］Evan, G.I., Vousden, K.H..Proliferation.Cell cycle and apoptosis in cancer［J］. Nature，2001, 411(6835)：342.