文章标题 全文   多个检索词，请用空格间隔。

       【摘要】 
       目的提高盾叶薯蓣药材的品质。方法通过组织培养，对诱导获得的盾叶薯蓣四倍体株系，进行了试管苗抗氧化酶活性及薯蓣皂苷元含量分析。结果大部分四倍体株系APX活性、SOD和POD比活力高于或相近于二倍体株系。经诱导获得的四倍体株系试管苗与对照相比薯蓣皂苷元含量有较大差异，大部分四倍体株系薯蓣皂苷元含量都超过了二倍体株系。结论经诱导获得的四倍体株系在抗氧化酶活性及有效成分含量方面与二倍体表现出明显差异，说明多倍体诱导可以作为盾叶薯蓣优良品种选育的途径。
       【关键词】  盾叶薯蓣　四倍体　抗氧化酶活性　薯蓣皂苷元
       Analysis of Antioxidant Enzyme Activities and Efficient Ingredients in Autotetraploid of D.  zingibiernsis C.H.Wright.
       XIE Caixia，SHI Huiqi，GAO Shanlin，HU Yanan，BAI Yu， BAI Yan
       1.Henan College of TCM, Zhengzhou ,450008, China；  2.China Pharmacological University,   Nanjing,210038, China；  3.Research Institute of Tianjin Tasly Group，Tianjin，300410，China
       Abstract：ObjectiveTo improve the yield and quality of D.  zingibiernsis C.H.Wright . MethodsThe research project of polyploidy breeding by tissue culture was done. The antioxidant enzyme activities and the diosgenin were analyzed in polyploidy lines. Results The results showed that SOD and POD activities in most of autotetraploid lines were not lower than those of diploid line, furthermore，the content of diosgenin in most induced plantlets was higher than that in control. Conclusion There was difference between  autotetraploid and control lines in diosgenin content and antioxidant enzyme activities，therefore，inducing autotetraploid can be effective way to breeding the superior varieties.
       Key words： D.  zingibiernsisC.H.Wright. ；Antotetraploid,；  Autioxidant enzyme activities；  Diosgenin
       
       盾叶薯蓣D.  zingibiernsis C.H.Wright.属薯蓣科薯蓣属根状茎，又名黄姜、火头根，其根茎内薯蓣皂素的含量一般为2%左右，是目前世界上最好的激素类药源植物。同时具有清肺止咳、利湿通淋、通络止痛、解毒消肿的功能，可治肺热咳嗽、湿热淋痛、风湿腰痛、痈肿恶疮、跌打扭伤、蜂螯虫咬；其水溶性甾体皂苷成分对心肌缺血、胸痹、高脂血症等有明显治疗作用。
        盾叶薯蓣是我国特有资源植物，是世界上薯蓣皂素含量最高的种类，最高单株达到16.5%，超过了世界王牌－墨西哥小穗花薯蓣15%的纪录。据调查我国10个省市都有盾叶薯蓣分布，其中湖北、湖南、陕西、四川分布最为集中，目前在陕西安康地区、湖北郧西地区、湖南安化地区、河南南阳地区都有一定规模的种植面积。实现人工栽培后，虽然解决了皂素供应问题，而原料依旧短缺，主要原因是产量低、皂素含量变化较大，质量难以控制。因此有必要进行品种选育和提纯复壮的工作。鉴于此，笔者利用组织培养技术进行了盾叶薯蓣多倍体的诱导，并对诱导株系进行了抗氧化酶活性及有效成分分析，为最终选育优良品种提供依据。
       1  材料与仪器
       1.1  材料生长25～40 d的盾叶薯蓣四倍体、二倍体试管苗新鲜叶片及根茎［1］。
       1.2  仪器和试剂BECKMAN DU-600分光光度计，水浴锅，微量加样器。酶提取液， pH 7.5的0.05mol/L 的Tris-HCl缓冲液，PBS pH(7.0)，0.1 mmol/L EDTA， 0.1mmol/L H2O2， 0.5 mmol/LASA，丙酮，SOD试剂盒（购于建成生物试剂研究所）。
       2  方法
       2.1  SOD，POD，APX活性的测定精密称取盾叶薯蓣试管苗二倍体及其同源四倍体叶片1.0 g，每份材料加5ml预冷的提取缓冲液（pH7.5的0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液）及少量石英砂，置于冰浴中研磨后，4℃冷冻离心机6 000 r/min离心10min，上清液即为酶提取液。SOD活性按南京建成生物工程研究所试剂盒说明书操作。POD总活力按文献［2］的方法进行，酶的比活力用ΔOD470/ (mg·min)(protein)表示。APX活性参照文献［2］的方法，酶活单位定义为每小时氧化1μmol ASA的酶量为一个酶活单位。
       2.2  盾叶薯蓣试管苗薯蓣皂苷元含量分析
       2.2.1  样品制作盾叶薯蓣试管苗在MS/2+IAA 0.2 mg/L+NAA0.2 mg/L培养基上诱导生根，待苗长至30～35d左右，洗净根上的培养基，将根剪掉，在60℃下烘干，粉碎，过60目筛，供含量分析用。
       2.2.2  薯蓣皂苷元的测定供试品溶液制备［3，4］：精密称取盾叶薯蓣粉末0.7～1.0 g，置于三角瓶中，加2.0 mol/L的硫酸50 ml，在100℃水浴锅中水解4 h，放冷过滤，药渣用蒸馏水洗至中性，60℃干燥后，用石油醚（60～90℃）50 ml在90℃水浴中索市氏提取5h，提取液回收至干后用无水乙醇溶解，过滤至5ml的容量瓶中，用无水乙醇定容待测定。
        对照品溶液制备：准确称取薯蓣皂苷元标样0.001 g，置2 ml容量瓶中，用无水乙醇溶解，稀释至刻度，得0.5 μg/μl的标准溶液备用。
        色谱条件选择［5，6］：仪器：Agilent 1100 Series。分析条件：Microsorb-MV100 C18 (5μm，4.6 mm×250  mm )。无水甲醇为流动相，进样量20 μl，流速0.5 ml/min, 检测波长203 nm, 柱温为室温。样品中薯蓣皂苷元与其它成分达到良好分离（见图1）。
        样品含量测定：以上述色谱条件对盾叶薯蓣中薯蓣皂苷元含量进行分析，并计算其含量。
       3  结果
       3.1  四倍体与二倍体SOD，POD，APX活性比较
        盾叶薯蓣二倍体与其同源四倍体各抗氧化酶的比较结果见表1。由表1可以看出，盾叶薯蓣四倍体株系APX活性基本上与二倍体相近或略大，其中有12个株系比二倍体高；14个四倍体株系POD活性均高于二倍体对照株系，平均高出23.4%，POD活性最高的株系G2比对照高出59%。16个四倍体株系SOD活性均高于二倍体对照。平均高出48.1%，活性最高的株系10-10比对照高出127%。表1  四倍体与二倍体SOD，POD，APX活性比较（略）
       3.2  盾叶薯蓣试管苗同源四倍体株系薯蓣皂苷元含量分析
        对诱导获得的19个四倍体株系试管苗的薯蓣皂苷元含量进行了初步分析。结果见表2，图2～4。测定结果显示：19个盾叶薯蓣四倍体株系中，有10个株系的薯蓣皂苷元含量高于二倍体，平均比对照株系高出30.8%。其中10-1、12-4、y9、3-1、y24、11-10，分别比对照株系高出75%，50%，50%，33%，25%，25%。表2  盾叶薯蓣四倍体株系薯蓣皂苷元含量（略）
       4  讨论
        目前，寻找强抗逆性植物，抵御活性氧对植物细胞的损伤越来越受到人们的重视。现已有通过基因扩增，使SOD过度表达，产生较强抗逆性的转基因植物。但由于SOD降解超氧阴离子产生的H2O2同样也是一种活性氧，对植物细胞也有很大伤害，因此单一通过转一种基因并不能达到彻底清除活性氧的目的。SOD在需氧原核生物和真核生物中广泛存在，是活性氧清除系统中第一个发挥作用的抗氧化酶，也是植物体内氧代谢的关键酶，在保护细胞免受氧化损伤过程中具有十分重要的作用。POD可清除植物体内的H2O2，从而使需氧生物体免受H2O2的毒害［7］，APX被认为叶绿体中清除H2O2的关键酶。试验获得的大部分盾叶薯蓣四倍体株系SOD，POD和APX比活力均高于二倍体，说明这些株系将具有比对照株系更高的抗逆性或抵抗自然灾害的能力。这为植物抗逆性的提高和产量的增加提供一条有效途径；极大的缩短了选育时间，为优良品种的前期筛选提供了新的研究思路；为应用组织培养技术进行优良品种选育提供了新的研究方法。
        成分分析结果说明大部分四倍体株系薯蓣皂苷元含量超过了对照株系，说明多倍体诱导可以作为盾叶薯蓣优良品种选育的途径，所得株系为进一步选育优良品种提供了有用的育种材料。
       【参考文献】
         　　［1］谢彩侠，高山林，秦慧贞，等.盾叶薯蓣同源四倍体的诱导与鉴定［J］.药物生物技术，2005，12（1）：15.
       
       ［2］张志良，翟伟蕾.植物生理学实验指导［M］. 北京：高等教育出版社，2006：168.
       
       ［3］都述虎，夏重道，付铁军，等． 穿龙薯蓣总皂苷水解条件的优化［J］. 中成药，2000，22（9）：608.
       
       ［4］王俊，杨克迪，陈 钧. 均匀设计法优选穿山龙的水解工艺条件［J］.中药材，2002，9：659.
       
       ［5］王铁杰， 刘中博，文琪珺，等.RP-HPLC法测定黄山药和穿龙薯蓣中薯蓣皂苷的含量［J］.中药材，2005，28 （12）： 1074.
       
       ［6］赵景婵，郭治安，成小飞，等. 穿龙薯蓣中薯蓣皂苷元的高效液相色谱法测定［J］.药物分析杂志，2000，20（1）：27.
       
       ［7］Breusegem F V, Slooten L, Stassart J M, et al. Effects of overproduction of tabacco Mn-SOD in maize chloroplasts on foliar tolerance to cold and oxidative stress［J］.J Exp Bot, 1999，50(330)：71.