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       【摘要】 
       目的研究金莲花中总黄酮抗氧作用的能力。方法用分光光度法测定金莲花总黄酮对O2-·、·OH、DPPH的清除作用和对红细胞膜的保护作用，并与维生素 C比较。结果金莲花总黄酮有抑制O2-·、·OH、DPPH的能力和保护红细胞膜的作用，金莲花总黄酮的浓度与抑制O2-·、·OH、DPPH的能力和保护红细胞膜的能力呈量-效关系。结论金莲花总黄酮具有较强抗氧作用。
       【关键词】  金莲花　总黄酮　抗氧化
        金莲花Trollius chinensis Bunge.为毛茛科植物金莲花的干燥花。据记载，金莲花的功效为清热解毒［1］。现代药理研究表明金莲花具有很好的抗菌、抗病毒作用［2］。金莲花中总黄酮是其有效成分。本实验通过研究金莲花总黄酮对超氧阴离子、羟自由基、DPPH清除能力与红细胞膜的保护作用证明金莲花总黄酮的抗氧作用。
       1  材料与仪器
       1.1  药品和试剂金莲花采自河北省张家口坝上地区，经河北北方学院中医系中药教研室马淑兰教授鉴定为金莲花。芦丁标准品（中国生物制品药品检定所），DPPH (二苯代苦味酰基苯肼自由基，美国），维生素C（中国生物制品药品检定所）。邻苯三酚，双氧水，邻二氮菲，硫酸亚铁，Tris-HCl，磷酸氢二钠，磷酸二氢钠，亚硝酸钠，硝酸铝，氢氧化钠均为分析纯。生理盐水，实验用水为三重蒸馏水。
       1.2  动物昆明种小鼠（由学校动物中心提供）。
       1.3  仪器DZ-1BC型真空干燥箱（天津市泰斯特仪器有限责任公司）；中药粉碎机(浙江省温岭市大海药材器械厂)；电热恒温水槽(上海精宏实验设备有限公司)；循环水式真空泵(巩义市英峪于华仪器厂)；756MC紫外可见光分光光度计(上海分析仪器总厂)；GR-202型分析天平（1/10万）(日本)；Heraeus低温高速离心机(德国)。
       2  方法与结果
       2.1  金莲花中总黄酮的提取、纯化、含量测定称取已洗净干燥粉碎的金莲花10.12 g，60%乙醇提取，提取两次，合并两次提取液，过滤，适当稀释，石油醚萃取，经D-101大孔树脂纯化，真空干燥成粉末即得金莲花总黄酮。采用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠比色法测定总黄酮含量为64.81%。
       2.2  金莲花总黄酮抗氧实验
       2.2.1  清除超氧阴离子自由基（O2-·）的活性［3］邻苯三酚在弱碱性Tris-HCl 缓冲液(pH8.2)溶液中自身氧化产生O2-·，随着反应进行O2-·在体系中不断积累，反应3 min后体系在322 nm 处的吸光度值随时间变化呈量效增大，而O2-·清除剂能使邻苯三酚自氧化产物在322 nm处吸收峰受抑制通过光化学方法测定A值，求抑制率。
        抑制率（%）=Acontrol-AsampleAcontrol×100%
       
       取6支具塞试管，依次加入pH值8.2的Tris-HCl 2.25 ml，三蒸水、总黄酮，在25℃水浴保温20 min，加入在25℃水浴保温的邻苯三酚(用10 mmol·L-1HCl 配置，浓度为3 mmol·L-1)后，准确反应3 min，加入10 mmol·L-1 的HCl 0.25 ml终止反应，终体积为5 ml。用相应空白试剂作对照，在322 nm处测吸光度值A。总黄酮的终浓度分别为 5，10，20，40，60 μg·ml-1，每管平行5次。以维生素C做阳性对照组，分别计算抑制率。见表1。表1  金莲花中总黄酮清除超氧阴离子的测定结果（略）
        求得总黄酮IC50 = 37.50 μg·ml-1，维生素C IC50= 3.10 μg·ml-1。
       2.2.2  对羟基自由基（·OH）的作用Fe2+/H2O2体系通过Fenton反应产生·OH，邻二氮菲-Fe2+被·OH氧化成邻二氮菲-Fe3+后，Fe2+与邻二氮菲形成的红色配合物颜色变浅，在510 nm处的吸光度值减小，当体系中加入·OH清除剂后，此氧化过程受抑制，用在510 nm处的吸光度值的变化高低来表明抗氧化能力高低。
        取7支试管，依次加入2.5 μg·ml-1的邻二氮菲0.5 ml，pH值 7.4的PBS 1ml，不同浓度的总黄酮，2 mmol·L-1的H2O2 0.5 ml，用三蒸水补足体积至5 ml，混匀后置37℃水浴中保温60 min，在510 nm处测吸光度值A。用相应空白试剂作对照。总黄酮的终浓度分别为50，60，70，80，90 μg·ml-1，每管平行5次。以Vit C做阳性对照组，分别计算抑制率（见表2）。求得总黄酮IC50= 72.51 μg·ml-1，维生素C IC50=7.60μg·ml-1。表2  金莲花中总黄酮清除·OH的测定结果（略）
        抑制率（%）=Asample-AblankAcontrol-Abland×100%
       2.2.3  对DPPH的影响［4］DPPH是以氮为中心的稳定自由基，在320 nm，517 nm处有两个吸收峰，当加入该自由基清除剂后吸收峰均减弱，但在517 nm处减弱明显，故选择测517nm处的A值来反映清除该自由基的能力。
        取7支试管，依次加入0.13 mmol·L-1的DPPH 2 ml，不同浓度的总黄酮，用无水乙醇补足体积至5 ml，混匀避光，暗室下反应20 min，取出后于517 nm处测吸光度值A，用相应空白试剂作对照。总黄酮的终浓度分别为 1，2，4，6，8，10 μg·ml-1，每管平行5次。以维生素 C做阳性对照组，分别计算抑制率（见表3）。求得总黄酮IC50= 5.90μg·ml-1，维生素C IC50= 2.30 μg·ml-1。表3  金莲花中总黄酮清除DPPH自由基的测定结果（略）
        清除率（%）=（1-Ai-AjAc)×100%
       2.2.4  对小鼠红细胞溶血的影响［5］自由基进攻红细胞膜上的多聚不饱和脂肪酸，使红细胞破裂导致溶血，当体系中加入自由基清除剂后，红细胞溶血变化的多少表明金莲花总黄酮抗氧化能力的高低。
        取昆明种小鼠，摘除眼球取血，肝素抗凝，用生理盐水洗涤4次(4℃,1 500 r·min-1离心6 min)至上清液澄清，取积压红细胞(RBC)用生理盐水制成1%的红细胞悬液50 ml。
        取7支10 ml离心试管，依次加入1%的RBC悬液2 ml，不同浓度的总黄酮,用生理盐水补足体积至1.9 ml，混匀后于37℃水浴保温10 min,再加入100 mmol·L-1的H2O2 0.1 ml，混匀后37℃水浴保温60 min,取出后加入生理盐水稀释5倍, 4℃,1 500 r·min-1 离心6 min，取上清液于415nm处测吸光度值A。用相应空白试剂作对照。总黄酮的终浓度分别为 10，20，30，40，50 μg·ml-1，每管平行5次。以Vit C做阳性对照组，分别计算抑制率（见表4）。求得总黄酮IC50= 32. 50 μg·ml-1，维生素C IC50=15.50 μg·ml-1。表4  金莲花总黄酮对H2O2引起红细胞溶血的影响（略）
        抑制率（%）=（1-Asample-AblankAmodel-Ablank)×100%
       3  讨论
        清除超氧阴离子实验中，邻苯三酚自氧化受HCl浓度影响。本实验采用5 ml的总体系中加入10 mmol·L-1 的HCl 0.25 ml终止反应。总黄酮和VitC清除O2-的能力均与浓度呈量效关系，总黄酮的IC50值比VitC大。
        清除·OH的实验中，加样顺序对实验的影响较大，文献多采用邻二氮菲、PBS、Fe2+加样顺序。本实验分别采用了3种加样顺序①邻二氮菲、PBS、Fe2+；②邻二氮菲、Fe2+、PBS；③Fe2+、PBS、邻二氮菲，在510 nm处测的吸光度值显示②>①>③，表明在PBS（pH=7.4）环境下，Fe2+受OH-作用可能会发生变化，而与邻二氮菲配合的数量减少。故实验中采用邻二氮菲、Fe2+、PBS加样顺序，使Fe2+与邻二氮菲先反应，生成稳定的配合物，避免PBS对Fe2+的影响。
       文献表明［8］，DPPH在固体状态下可以稳定存在，但制成溶液后稳定性降低，常温下只能稳定存在5 h，要求DPPH要现用现配。而在本实验中，测得空白组在3，4，5，6，8，10h的吸光度值依次为0.564，0.566，0.564，0.569，0.561，0.564。计算求得RSD=0.47%，说明DPPH制成溶液后经过放置至10 h仍然是稳定的。
        抗红细胞氧化损伤实验中，文献方法均用3 000 r·min-1离心而用显微镜观察发现红细胞破坏较多，而且细胞形态不规则。本实验经探索在文献基础上，改进为1 500 r·min-1离心。
        黄酮类化合物基本结构为B环上的3"，4"-邻位二羟基是具有清除自由基生物活性的关键结构［6］。金莲花总黄酮中主要含有荭草苷、牡荆苷、槲皮素-3-O-新橙皮糖苷和槲皮素-3-O-巢菜糖苷等黄酮类成分，其中荭草苷、槲皮素-3-O-新橙皮糖苷和槲皮素-3-O-巢菜糖苷均有与黄酮类基本母核结构相似的B环3"，4"-邻位二羟基（周欣《短瓣金莲花黄酮类成分制备工艺、质量标准及抗氧化活性研究》第二军医大学,2006）。实验结果表明金莲花总黄酮有较强的抗氧作用。
        本实验以维生素 C做阳性对照，研究发现金莲花总黄酮对超氧阴离子、羟自由基、DPPH清除能力与红细胞膜的保护作用的IC50值比维生素 C IC50值低。金莲花总黄酮具有抗氧作用。
       【参考文献】
         　　［1］江苏新医学院.中药大辞典，上册［M］.上海:上海人民出版社，1977：1398.
       
       ［2］林秋风，冯顺卿，李薇兰，等.金莲花抑菌抗病毒活性成分的初步研究［J］. 浙江大学（理学版）,2004,31（4）:412.
       
       ［3］刘静.杜仲叶提取物的体外抗氧化作用［J］.陕西教育学院学报，2007，23（2）：65.
       
       ［4］陈季武，胡斌，赵实，等.天然黄酮类化合物清除DPPH的构效关系［J］.食品科学，2005，26（5）：664.
       
       ［5］张小郁,高明堂,李文广.葡萄籽提取物体外抗脂质过氧化作用的研究［A］.郑荣梁.自由基生命科学进展［M］.北京：原子能出版社,1999:116.
       
       ［6］魏红,丰帆,陈旭丹,等.4种中药黄酮提取物清除自由基活性的研究［J］. 天津师范大学学报(自然科学版)，2008,28(2):14.