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       【摘要】 
       目的探讨口虾蛄提取物对体外人鼻咽癌细胞系CNE-2Z转移潜能的影响。方法用细胞-基质粘附实验、细胞运动实验及侵袭实验检测口虾蛄提取物对CNE-2Z细胞粘附、运动及侵袭能力的影响；免疫细胞化学法检测其对MMP-2、MMP-9及CD44v6蛋白表达的影响。结果口虾蛄提取物能以量-效方式抑制CNE-2Z细胞体外运动及侵袭能力（P＜0.01），但对CNE-2Z细胞-基质粘附能力无影响（P＞0.05）。且口虾蛄提取物能降低MMP-2、MMP-9及CD44v6蛋白强阳性表达率（P＜0.01）。结论口虾蛄提取物可抑制体外CNE-2Z细胞的运动及侵袭能力,其机制可能与下调CD44v6、MMP-9和MMP-2蛋白表达有关。
       【关键词】  口虾蛄　口虾蛄提取物　 鼻咽肿瘤　肿瘤转移
        近年来，研究发现海绵、海藻及珊瑚等多种海洋生物均含丰富的抗瘤活性物质［1］，提示从海洋生物筛选抗肿瘤新药具有广阔的前景。口虾蛄(Oratosquilla)，又称濑尿虾，属于节肢动物门，是日常食用的海洋生物之一。目前，有关口虾蛄抗肿瘤的报道甚少。本课题组近年研究发现口虾蛄提取物能抑制人低分化鼻咽癌细胞系CNE-2Z的生长［2，3］，但能否抗肿瘤侵袭及转移尚不清楚。本文旨在探讨口虾蛄提取物对CNE-2Z细胞转移潜能的抑制作用，为口虾蛄抗肿瘤作用提供实验依据。
       1  材料
        新鲜口虾蛄购于广东湛江港口，Matrigel（Becton Dickinson Labware,USA), Human Fibronctin（Becton Dickinson Biosciences,USA), Transwell (6.5 mm Diameter，8.0 μm Pore Size，Corning Coster Corporation, USA)，鼠抗人MMP-2、MMP-9、CD44v6单克隆抗体、超敏广谱S-P试剂盒（KIT-9710）及DBA显色剂（DAB-0031）为福州迈新生物技术公司产品。
        CNE-2Z为人低分化鼻咽癌细胞系,由广东医学院肿瘤研究所提供。
       2  方法
       2.1  口虾蛄有效成分提取与配制新鲜口虾蛄暴晒干后粉碎成粉末，用95%乙醇浸泡3次，每次浸泡液过滤混匀在56℃蒸发提纯。提纯物呈膏状，每克药物相当于生药3.81 g。提取物用二甲基亚砜（DMSO）配成1 000 g · L-1，4℃保存，临用时用培养液稀释成所需浓度，以下实验均分4组：溶剂对照组、口虾蛄提取物低浓度组（200.0 mg ·L-1）、口虾蛄提取物中浓度组（400.0 mg ·L-1）及口虾蛄提取物高浓度组（800.0 mg · L-1）。
       2.2  细胞-基质粘附实验Matrigel按2.0 μg/孔铺于96孔培养板中，风干过夜。CNE-2Z细胞常规培养，以每孔4×104/100 μl接种，并加入不同浓度的口虾蛄提取物，每组设12个平行孔，培养8 h后倒掉培养液，结晶紫100μl/孔染色10 min，PBS洗涤3次。加入醋酸乙醇100 μl/孔，酶标仪测定A570 nm值。实验重复2次。
       2.3  细胞侵袭及运动实验Transwell上室腔内加入稀释好的Matrigel（10 μg)，风干过夜。24孔培养板内加入10 μg/ml纤维粘连蛋白的完全培养液（600 μl/孔）。收集CNE-2Z细胞，用含1%牛血清白蛋白的RPMI 1640制成1×106/ml细胞悬液，以100 μl/室加入上室腔，同时加入不同浓度的口虾蛄提取物，每组设平行小室3个，小室浸于24孔板的条件培养基中培养24 h，取小室，甲醇∶丙酮（1∶1）固定10 min，擦去未穿膜的细胞，HE染色，光学显微镜下随机选择5个视野，计数细胞数目，取均值。运动试验除不铺Matrigel外，其余步骤相同。
       2.4  免疫细胞化学法①CNE-2Z细胞接种在一次性塑料培养皿中，同时加入不同浓度的口虾蛄提取物，常规培养24 h后弃培养液，用PBS冲洗3次，冷丙酮：甲醇（1∶1）固定10min，晾干。②免疫组化染色：参照S-P试剂盒说明。③结果观察：每组选用上下左右中五个区域，记数500个细胞，胞浆或和胞膜着色淡黄为弱阳性（+），着色棕黄为阳性（++），着色棕褐为强阳性（+++），无着色为阴性（-）。
       2.5  统计学分析用统计学软件SPSS for Window 11.5中单因素方差分析One-Way ANOVA(Post Hoc Test:LSD test) 及R×C Table Descriptive statistics (Crosstabs,Chi-square)。
       3  结果
       3.1  粘附实验结果不同浓度口虾蛄提取物组OD值变化不大。溶剂对照组、口虾蛄提取物200.0，400.0，800.0 mg · L-1组OD值分别为1.313±0.073，1.320±0.058，1.304±0.052及1.306±0.085。组间差异无统计学意义（P＞0.05）。
       3.2  细胞运动实验结果随口虾蛄提取物浓度的增高，穿PVPF膜的细胞数渐减少（见图1），呈量-效关系。溶剂对照组及口虾蛄提取物低、中、高浓度组穿膜细胞数分别为84.67±5.15，36.07±5.46，31.00±2.60及15.60±2.16。组间差异有显著性（P＜0.01）。
       3.3  细胞侵袭实验结果随口虾蛄提取物浓度的增高，穿PVPF膜的细胞数也渐减少（见图2），呈量-效关系。溶剂对照组及口虾蛄提取物低、中、高浓度组侵袭细胞数分别为（102.27±3.91），（54.82±4.39），（45.60±2.03）及（38.47±2.48）。组间差异有显著性（P＜0.01)。
       3.4  免疫细胞化学法结果CNE-2Z细胞CD44v6主要在细胞膜上表达，均呈阳性或强阳性表达。随口虾蛄提取物浓度的增高CD44v6表达有下降的趋势，溶剂对照组及口虾蛄提取物低、中、高浓度组CD44v6强阳性表达率分别为46.6%(233/500)、45.6%(228/500)，38.0%(190/500)和30.6%(153/500)，组间差异有显著性 (P＜0.01)。
       
       MMP-9及MMP-2主要表达CNE-2Z细胞膜及胞浆，呈阳性或强阳性表达。溶剂对照组及口虾蛄提取物低、中、高浓度组MMP-9强阳性表达率分别为48.8%(244/500)，43.6%(218/500) ，29.2%(146/500) 及29.0%(145/500)；而MMP-2强阳性表达率分别为28.0%(140/500)，10.0%(50/500)，6.6%(33/500)及6.0%(30/500)。两者强阳性表达率均随口虾蛄提取物浓度增高而降低，差异均具有显著性（P＜0.01)。
       4  讨论
        鼻咽癌又称“广东癌”，放疗为其治疗的主要手段，但晚期患者的5年生存率仅30％左右，放疗失败的主要原因是局部复发和远处转移，其中远处转移是患者死亡的主因。
        在恶性肿瘤侵袭和转移过程中，癌细胞间及其与细胞外基质、正常细胞间的粘附作用、细胞外基质的降解和癌细胞运动游走能力起着重要作用，是决定恶性肿瘤能否发生侵袭转移的3个关键因素。因此，通过观察药物对癌细胞粘附、侵袭以及运动能力的影响可判断其能否抑制肿瘤转移潜能。本实验粘附实验结果发现不同浓度口虾蛄提取物组OD值变化不大（P＞0.05），提示其对CNE-2Z细胞-基质粘附能力可能无抑制作用。细胞运动实验结果发现随着口虾蛄提取物浓度的增高，穿过PVPF膜的CNE-2Z细胞数渐减少，呈量-效关系（P＜0.01)，提示其对CNE-2Z细胞运动能力有抑制作用。而细胞侵袭实验结果显示随口虾蛄提取物浓度的增高，侵袭人工基底膜后穿过PVPF滤膜的CNE-2Z细胞数也渐减少，呈量-效关系（P＜0.01)，提示其对CNE-2Z细胞侵袭能力也有抑制作用。
        CD44为细胞表面胯膜糖蛋白，研究表明CD44拼接异构体的CD44v6与癌侵袭、转移密切相关［4］，CD44v6异常表达可能与鼻咽癌转移密切相关［5］，CD44v6可通过影响了肿瘤细胞的运动能力而参与肿瘤的侵袭转移过程［6］。本实验结果发现随口虾蛄提取物浓度的增高CD44v6表达有下降的趋势，组间差异有显著性（P＜0.01)，提示了口虾蛄提取物对CD44v6表达有抑制作用，从而降低CNE-2Z细胞的运动能力。
        基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）家族成员中的Ⅳ型胶原酶与恶性肿瘤侵袭及转移关系最密切，是近年研究热点之一。目前发现Ⅳ型胶原酶有两种:72KD型和92KD型Ⅳ型胶原酶，即MMP-2及MMP-9，两者的过度表达与肺、前列腺及乳腺等多种器官恶性肿瘤的侵袭和转移密切相关。有研究表明MMP-9和MMP-2与鼻咽癌侵袭转移有关［7，8］。本实验结果显示MMP-2及MMP-9蛋白表达也随口虾蛄提取物浓度增高而降低，呈量效关系（P＜0.01)，提示了口虾蛄提取物可抑制MMP-2及MMP-9表达，从而降低CNE-2Z细胞的侵袭能力。
        综上所述，口虾蛄提取物可能同时抑制了CD44v6、MMP-9和MMP-2蛋白表达而降低CNE-2Z细胞的运动及侵袭能力，从而抑制了CNE-2Z细胞的转移潜能。由此可见，口虾蛄提取物中可能含有抗鼻咽癌侵袭及转移的活性成分，至于其起作用的具体活性成分是什么，有待进一步的研究。
       【参考文献】
         　　［1］T. Luke S, Eric A, Kerry MP, et al. Marine natural products as anticancer drugs ［J］. Mol Cancer Ther，2005,4(2):333.
       
       ［2］顾帝水，黄培春，孔 霞，等.口虾蛄提取物对人鼻咽癌裸鼠移植瘤生长的影响［J］.现代中西医结合杂志,2005,14(14):1825.
       
       ［3］叶才果，潘海燕，黄培春，等.海洋来源的口蛄虾生物碱的分离纯化和抗鼻咽癌作用研究［J］. 时珍国医国药,2008,19(12):2965.
       
       ［4］Kainz C , Tempfer C , Kohlberger P , et al . Immunohistochemical detection of adhesion molecule CD44 splice variants in lymph node metastases of cervical cancer［J］. Int J Cancer , 1997，74 : 185.
       
       ［5］卓明英, 杨 军, 林 昶，等. CD44v6基因蛋白在鼻咽癌的表达及意义［J］. 临床肿瘤学杂志,2001,6(1):25,31.
       
       ［6］Afify A, Purnell P, Nguyen L. Role of CD44s and CD44v6 on human breast cancer cell adhesion, migration, and invasion［J］. Exp Mol Pathol，2009, 86(2):95.
       
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       ［8］Horikawa T, Yoshizaki T, Sheen TS, et al. Association of latent membrane protein 1 and matrix-metalloproteinase 9 with metastasis in nasopharyngeal carcinoma［J］. Cancer, 2000, 89(4):715.