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       【摘要】 
       目的优化葎草多糖的超声辅助提取工艺，并研究其抑菌活性。方法以多糖中的葡萄糖含量为指标，对超声波功率、料液比和超声时间进行L9（34）正交实验，确定超声辅助提取葎草粗多糖的最佳工艺。用DE-52交换柱对葎草粗多糖进行分离，以滤纸片法研究葎草粗多糖和多糖分离组分的抑菌能力。结果以水为提取溶剂，料液比1∶28（g/ml），超声功率120W，超声90 min提取2次，葎草多糖的得率为0.755％。葎草粗多糖的抑菌效果具有一定的剂量依赖性；各多糖组分中HSP-Ⅰ、HSP-Ⅲ、HSP-Ⅳ发挥主要抑菌作用，其中HSP-Ⅰ效果最显著，HSP-Ⅱ抑菌效果不明显，且各组分间表现出协同关系。结论超声波辅助提取葎草多糖方法可行，得率高。葎草多糖具有抑菌活性。
       【关键词】  葎草　多糖　分离　抑菌活性
       Study on Ultrasound-assisted Extraction and Antibacterial Activity of Polysaccharides from Humulus scandens
       CHU Yanliang, WANG Na, ZHANG Mingchuan
       College of Biological and Environmental Engineering,Jiangsu University of Science and Technology, Zhenjiang 212018, China
       Abstract：ObjectiveTo optimize the ultrasound-assisted extraction method and to study the antibacterial activity of polysaccharides from Humulus scandens. MethodsTaking the content of glucose as observation index, we optimized the extraction process by L9（34）orthogonal experiment. The Humulus scandens polysaccharides (HSP) was purified into HSP-Ⅰ, HSP-Ⅱ, HSP-Ⅲ and HSP-Ⅳ by ion exchange chromatography with DE-52. The antibacterial activity of each component was tested by means of filter paper.ResultsThe optimal extraction conditions were obtained as follows: water refluxing, a ratio of solid -liquid as 1g:28ml,120W for the intension of ultrasonic power, extracting time 90min and extracting two times. Under aforesaid optimization conditions, the yield of polysaccharides was 0.755%. Antibacterial experiments indicated that the inhibitory effect of crude polysaccharides showed dose-dependent. Among the isolated components, HSP-Ⅰ, HSP-Ⅲ, HSP-Ⅳ played main antibacterial roles and HSP-Ⅱ was ineffective. It was cooperative with different isolated components. ConclusionThe yield of Humulus Scandens polysaccharides is high with ultrasound-assisted extraction method. The Humulus scandens polysaccharides has obvious antibacterial action.
       Key words：Humulus scandens;   Polysaccharides;   Isolation;   Antibacterial activity
        葎草Humulus scandens (Lour.)Merr.又名拉拉藤，拉拉秧，一年生或多年生草本植物，全国各地几乎均有分布。葎草生长旺盛，富含营养，既可以作为饲料，提高饲喂动物的生长状况，又可以药用，有清热解毒、利尿消肿之功效［1］。据文献报道，葎草中含有木犀草素、葡萄糖苷、胆碱、挥发油、鞣质、树脂、天门冬酰胺等物质［2］，其提取物具有抗结核菌的功效［3］，因而渐渐引起人们的研究兴趣。近年对于葎草中的木犀草素、黄酮类物质的提取已有少量研究［4，5］，但对葎草中多糖类物质的提取和活性研究还未见报道。本文采用超声波辅助提取方法制备葎草总多糖，并对多糖的抑菌活性进行研究，以期为这一优势植物资源的开发利用提供一定的理论依据。
       1   材料与仪器
       1.1  材料葎草，采自江苏科技大学校园内，晾干后粉碎过100目筛，干粉于干燥器中密封保存。大肠杆菌Escherichia coli、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus、苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis、链球菌Streptococcus，由本校生物与环境工程学院微生物实验室提供。牛肉膏蛋白胨培养基（牛肉膏3.5 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，琼脂 20.0 g，水1 000 ml，pH 7.0～7.2，121℃灭菌30 min）。
       1.2  试剂葡萄糖、硫酸、苯酚、活性炭、乙醇、牛肉膏、蛋白胨等，均为国产分析纯。
       1.3  仪器UV-9100紫外分光光度计，KQ5200DB型数控超声波清洗器，FA2104型电子精密天平，Avanti J-25高效大容量冷冻离心机（Beckman），DHG-9203A型电热恒温鼓风干燥箱，瑞士Buchi旋转蒸发浓缩仪，HWS-20恒温水浴箱，超净工作台等。
       2  方法
       2.1  多糖的提取与纯化
       2.1.1  超声波提取工艺以水为提取溶剂，选择超声波提取功率、提取时间和料液比3个因素，各取3个水平，以多糖含量为实验指标，进行L9（34）正交实验。
       2.1.2  粗多糖的制备准确称取葎草干粉500.0 g，按最优工艺提取，得多糖粗提液。粗提液减压浓缩至200～300 ml后离心，上清液加入95％乙醇醇沉；沉淀物蒸馏水复溶，10%三氯乙酸除蛋白；上清液活性炭脱色，透析袋透析后再次醇沉，沉淀依次用乙醇、丙酮洗涤，挥去残余水分，真空干燥，即得葎草粗多糖（HSP）干品。
       2.1.3  粗多糖的分离纯化 将70.0 g二乙胺基乙基纤维素（DE-52）依次用500 ml双蒸水、500 ml 0.5mol/L的氢氧化钠、盐酸、氢氧化钠处理，0.5 h/次，不时搅拌，并用双蒸水处理至中性，装柱柱规格：2.5 cm×30 cm。精密称取HSP100.0 mg上样，在室温下依次用0，0.2，0.4，0.8，1.0mol／L NaC1溶液梯度洗脱，洗脱速度5.0 ml/min，每管收集5.0 ml。苯酚-硫酸法［6］跟踪检测，收集洗脱高峰部分，透析后减压浓缩，即得精制的葎草多糖组分。
       2.2 多糖含量的分析方法
       2.2.1  多糖含量的测定采用硫酸-苯酚法［6］。精密称取105℃干燥至恒重的葡萄糖20.0 mg，置于100 ml容量瓶中，蒸馏水定容为标准溶液。分别量取一定体积的标准溶液，配成浓度为0，10，20，30，40，50，60 μg/ml的葡萄糖稀释液。精密吸取上述稀释液各1.0 ml，置于10 ml容量瓶中，加入5％的苯酚溶液1.0 ml，摇匀后再加入浓硫酸5.0 ml，充分混匀后放置30 min，冷却到室温后，在波长490 nm处测定吸光度，绘制标准曲线（回归方程为Y = 0.011 1X-0.014 1， r=0.999 1）。
       2.2.2   换算因子测定精密称取80℃干燥至恒重的纯化葎草多糖HSP-II 10.0mg，加蒸馏水定容至50ml，配成葎草多糖储备液。苯酚硫酸法测定吸光度，测得其葡萄糖含量。
        换算因子= W/C×D。式中：W为所取的纯化多糖重量（mg），C为多糖储备液中葡萄糖质量（mg），D为多糖的稀释因素。实验测定结果换算因子为4.47。
       2.2.3   多糖含量计算多糖含量(%)=（C×D×F/W）×100%。式中：C为供试液中葡萄糖含量（mg），D为多糖溶液的稀释倍数，F为换算因子，W为供试葎草干粉的重量（mg）。
       2.3   葎草多糖的抑菌活性［7，8］将供试菌种分别接种到装有培养基的试管内，进行扩大培养（37℃培养24 h）。取活化好的菌种斜面，用无菌生理盐水配制成106个／ml的菌悬液，备用。抑菌作用的测定采用滤纸片法。将滤纸用打孔器打成直径为6 mm的圆形小纸片，分装于洁净干燥的小培养皿中，干热灭菌(160℃，2 h)后备用。将葎草多糖配置成不同浓度溶液，用无菌镊子将滤纸片放入溶液中，另取滤纸片放入蒸馏水中作阴性对照，放入10mg/红霉素中作阳性对照，均浸泡24 h。取制备好的菌悬液0.2 ml，滴入已经倒有固体培养基的平皿表面，用涂布器使其均匀分布。用无菌镊子夹取浸有上述样品的滤纸片，放入含菌平皿中，每皿3片。按上述相应条件培养，每种菌作3个重复试验，量取抑菌圈直径，取平均值。
       3  结果
       3.1  超声波功率对葎草多糖含量的影响在其他条件一致的情况下（水为提取溶剂，料液比1∶30，提取时间90 min），取不同的超声波功率80，100，120，140，160，180 W和200W提取多糖，提取两次，合并滤液，计算多糖含量。实验结果如图1所示。由图1可知，随着超声波功率的增加，葎草多糖的含量呈现出一定的波动，分别在100W和160W处出现两个峰值，且100W的含量高于160W。超声功率增加，对细胞壁的机械剪切作用增强，使细胞内多糖溶出率增加，溶液中多糖含量也相应提高。但随着功率的进一步增加，在促进多糖溶出的同时，对多糖的破坏作用也在加强，进而导致多糖含量逐渐下降。考虑到多糖含量和能耗多少，多糖的提取功率以100W较为适宜。
       3.2  提取时间对葎草多糖含量的影响固定料液比1∶30，按照不同的处理时间，采用超声波功率100W分别提取两次，合并滤液，计算多糖含量，实验结果如图2所示。由图可知，多糖从细胞的溶出量与超声波作用的时间长短有关，随着浸提时间延长，由超声波引起的剪切作用和空化作用导致多糖溶出量持续上升，在处理时间为120min时多糖含量达到最高，比处理60min实验组的多糖含量多出66.9％。但时间过长，游离于溶液中的多糖分子又受到超声波的持续作用导致分子断裂，引起多糖含量下降，浸提150min后，多糖含量只有最高值的71.4％。由此可以得出超声波提取时间应以120min为宜。
       3.3   料液比对葎草多糖含量的影响按照不同料液比（g/ml），以超声波功率100 W提取120 min，合并两次滤液，测定并计算多糖含量，结果如图3所示。溶剂用量对提取液中的多糖含量有较明显的影响。随着提取溶剂用量的逐渐上升，物料与溶剂的接触面扩大，多糖自细胞溶出后能更加充分的扩散到溶液中，多糖含量逐渐上升，当料液比1∶25时达到最大值。此后随着提取溶剂的继续增加，物料过于分散，超声波的作用相对减弱，使多糖溶出量较少，多糖含量下降。同时，液料比过大会导致溶剂浪费，多糖分离困难，后续操作成本增加，根据图3结果，料液比选择1∶25为宜。
       3.4  正交实验在单因素实验的基础上，以超声波功率、浸提时间和料液比作为主要因素进行正交试验设计，葎草干粉用量为每份1.0g，对提取液中的多糖含量进行测定计算，结果见表1。由表1可知，在所试的3个因素中，料液比对提取液中多糖含量影响最大，时间次之，功率影响最小。其理论最优提取工艺为A3B1C3，即功率120 W，时间90 min，料液比1∶28，其组合条件不在本次正交实验组中，按照A3B1C3进行补充实验，其提取液中的多糖含量为0.755%，高于正交实验中的最高值。因此，采用超声波进行辅助提取时，按1∶28料液比，120 W超声波功率，浸提90 min时，多糖含量达到最高值。表1  正交实验结果分析（略）
       3.5   葎草粗多糖的分离采用DE-52进行粗多糖的初步分离。根据跟踪测量结果，以试管编号为横坐标，多糖的量为纵坐标做洗脱色谱图（图4）。根谱图准确收集了HSP-Ⅰ、HSP-Ⅱ、HSP-Ⅲ和HSP-Ⅳ4种组分。各种组分经浓缩醇沉干燥，得质量分别为：10.4，39.83，23.58和8.6mg。用双蒸水洗脱的色谱峰HSP-Ⅰ为中性多糖，不同离子强度的氯化钠溶液的洗脱峰为酸性多糖。
       3.6   葎草多糖对细菌的作用效果将制备的葎草粗多糖配成1.0，10.0，100.0 mg/ml 3个浓度的水溶液，采用滤纸片法进行葎草粗多糖的抑菌实验，结果见表2。由表2可知，葎草粗多糖对4种菌均有不同程度的抑制作用，且随着葎草粗多糖浓度的加大，抑菌作用也逐渐增强。相同浓度下，多糖溶液对大肠杆菌的抑菌效果最好，明显大于对其他菌种的抑制作用，这可能与大肠杆菌为革兰氏阴性菌，其他菌种为阳性菌有关。
        将HSP-Ⅰ、HSP-Ⅱ、HSP-Ⅲ、HSP-Ⅳ均配成10.0mg/ml的溶液，进行抑菌实验，结果如表3所示。由表3可知，葎草多糖各组分的抑菌效果存在较大的差异性。HSP-Ⅰ和HSP-Ⅲ对大肠杆菌具有很强的抑制作用，但对苏云金芽孢杆菌的抑制作用很弱，对后者的抑菌圈直径仅为对前者抑菌圈直径的17%。和26%HSP-Ⅰ和HSP-Ⅳ对金黄色葡萄球菌的抑制作用较强，明显高于HSP-Ⅱ和HSP-Ⅲ的抑制效果。此外对链球菌起到抑制作用主要是HSP-Ⅰ，其他组分作用则很弱。而对苏云金芽孢杆菌的抑菌效果，4种多糖组分都很微弱，几乎没有，但是葎草粗多糖对其抑菌效果却较好，可能是通过4种组分中的两种或几种协同作用实现的。总体看来，HSP-Ⅰ的抑菌作用最为明显，HSP-Ⅱ的抑菌效果最小，但从分离所得含量上来看，后者明显高于前者，因此葎草的抑菌活性更多的应是不同组分之间的协同作用。表2  葎草粗多糖作用于不同菌种的抑菌圈直径cm（略）表3  葎草多糖组分作用于不同菌种的抑菌圈直径cm（略）
       4  结论
        葎草叶片超声辅助水提取的工艺简单，成本较低，得率较高，最佳提取工艺为：料液比1∶28（g∶ml），超声波功率120W，提取时间90min，提取两次，多糖得率可达0.755%。
        葎草粗多糖经DE-52柱层析分离后可得四种组分：HSP-Ⅰ、HSP-Ⅱ、HSP-Ⅲ和HSP-Ⅳ，其中HSP-Ⅱ含量最大。
        葎草叶片多糖对大肠杆菌、苏云金芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和链球菌均有一定程度的抑制作用，因而在食品防腐和医药领域的开发前景广阔。
       【参考文献】
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