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       【摘要】 
       目的研究三七皂苷R1在大鼠体内的代谢情况，阐述三七皂苷R1在大鼠体内的代谢产物。方法以三七皂苷R1的微生物转化产物为对照品；采用LC-ESI-MS/MS方法，检测大鼠体内的代谢产物。结果在大鼠体内共检测到8个代谢产物，并利用对照品鉴定了它们的结构分别为：20(S)-三七皂苷R2，20(R)-三七皂苷R2，20(S)-人参皂苷Rh1，20(R)-人参皂苷Rh1，人参皂苷Rh4，原人参三醇，人参皂苷F1和3β, 12β -二醇达玛烷-E-20(22),24-二烯-6-O-β-D-木糖-(1→2)-β-D-葡萄糖苷。结论三七皂苷R1在大鼠体内的代谢产物较多，且与微生物转化产物具有很强的相似性。
       【关键词】  三七皂苷R1　 代谢产物　 高效液相色谱-质谱联用
       Metabolites of Notoginsenoside R1 in Rats
       CHEN Guangtong, YANG Min
       1.Nantong University, Nantong 226001, China; 2.Shanghai Research Center for Modernization of Traditional Chinese Medicine, Shanghai Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 201203, China
       Abstract:ObjectiveTo investigate the metabolites of notoginsenoside R1 in rats. MethodsThe microbial transformation metabolites of notoginsenoside R1 were used as standard references. LC-ESI-MS/MS analysis was used in the metabolism studies of notoginsenoside R1 in rats. ResultsThe structures of eight metabolites of notoginsenoside R1 in rat feces were identified by comparison with the reference standards separated from biotransformation. Their structures were identified as 20(S)-notoginsenoside R2, 20(R)-notoginsenoside R2, 20(S)-ginsenoside Rh1, 20(R)-ginsenoside Rh1, ginsenoside Rh4, protopanaxatriol, ginsenoside F1 and 3β, 12β-dihydroxydammar-E-20(22)-24- diene-6-O-β-D-xylopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranoside.ConclusionNotoginsenoside R1 is extensively metabolized in rat and has the same metabolic pathway with microorganisms to some extent.
       Key words:Notoginsenoside R1;  Metabolites;  LC-MS/MS
       
       三七 Panax notoginseng (Burk) F. H. Chen是我国的传统珍贵药材，具有止血、散瘀、消肿、止痛等功效。三七中的达玛烷型三萜皂苷是其主要有效成分之一，所含的达玛烷型三萜皂苷包括原人参二醇型和原人参三醇型［1］。三七皂苷R1属于原人参三醇型，是三七中最具有代表性的特征化合物（见图1），具有镇痛、保护缺血后细胞［2］等作用。近年来,虽然对三七皂苷R1的药物动力学研究已有报道［3］，但尚未见三七皂苷R1的体内代谢产物研究报道。由于药物的体内代谢产物往往与其微生物转化产物具有一定的相似性，因此，微生物转化可以作为药物代谢的模型，辅助鉴定其代谢产物［4～6］。本实验以前期工作中分离得到的三七皂苷R1微生物转化产物为对照品，利用LC-ESI-MS/MS技术，对三七皂苷R1在大鼠体内的代谢进行了研究，鉴定了8个代谢产物的结构，并探讨了此化合物在微生物与大鼠体内代谢的相似性。
       1  材料与方法
       1.1  质谱条件液质联用仪TSQ Quantum LC-MS (San Jose，CA，USA)，使用Finnigan Xcalibur 数据处理系统。Thermo 液相色谱仪， Agilent Zorbax SB-C18 反相色谱柱(5 μm，250 mm×4.6 mm)，Agilent Zorbax SB-C18保护柱(5 μm，20 mm×4 mm)。
       1.2  药品与试剂色谱纯乙腈 (Merck, Darmstadt, Germany)，去离子水经过Milli-Q系统纯化 (Millipore, Bedford, MA, USA)，三七皂苷R1 (昆明众正生物科技有限公司，纯度大于98%)，其余人参皂苷对照品由作者采用微生物转化方法获得，其纯度均大于95%［7］。其余试剂均为分析纯 (国药集团化学试剂公司)。
       1.3  样品的采集及处理Sprague-Dawley大鼠6只，雄性，体质量200～220 g。饲养3 d，待其充分适应环境后，禁食24 h (自由饮水)，同时接取粪便做为空白。大鼠按100 mg·kg-1剂量灌胃给予三七皂苷R1，置于代谢笼中，继续禁食，于给药后24，48，60和72 h 收集粪便，冷冻保存，待处理。将1 g粪便称重后研磨，加入2 ml甲醇超声提取30 min后于3000 r/min离心10 min，上清液经0.45 μm滤膜过滤，续滤液备用。
       1.4  HPLC-DAD分析条件流动相为乙腈-水，梯度洗脱程序为0 ～ 30 min，由15％的乙腈线性升至22％；50 min，升至30％；80 min，升至40％；120 min，升至60％。流速为1.0 ml·min-1，柱温为30℃，检测波长为203 nm。进样量20 μl。
       1.5  LC-MS分析条件流动相为乙腈-0.2%醋酸水，梯度洗脱程序为0 ～ 10 min，由20％的乙腈线性升至22％；20 min，升至30％；50 min，升至40％；70 min，升至60％。电喷雾离子化(ESI)源，正离子模式；质谱条件经过反复优化，最终确定为：鞘气流速为40 arb；助气流速为10 arb；喷雾电压为4.5 kv；毛细管温度为300℃。
       2  结果
       2.1  代谢产物HPLC分析取粪便样品溶液，在“1.4”项色谱条件下进行HPLC-DAD检测分析。共检测到底物三七皂苷R1和7个代谢产物M1～M7的色谱峰。见图2。经与对照品进行比对确定代谢产物的结构分别为：20(S)-三七皂苷R2 (M1)、20(R)-三七皂苷R2 (M2)、20(S)-人参皂苷Rh1(M3)、20(R)-人参皂苷Rh1(M4)、人参皂苷Rh4(M5)、原人参三醇 (M6)和人参皂苷F1(M7)。同时记录所测的底物和4个主要的代谢产物的色谱峰面积，与时间作图，记录粪便中的含量变化。见图3。
       2.2  代谢产物LC- MS/MS分析样品经LC/MS/MS分析，进行全离子和选择离子扫描，检测到了底物及8个代谢产物M1～M8。其LC/MS选择离子流图见图4。分别对8个代谢产物进行MS和MS/MS分析，将所得的碎片离子与对照品的相比较。
        在MS谱中，M1和M2均显示m/z 771［M+H］+的准分子离子峰，比三七皂苷R1的m/z 933 ［M+H］+少162 amu，提示均为脱去一分子葡萄糖基的代谢产物。在MS/MS谱中上述两个代谢产物均显示了3个主要的碎片离子峰m/z 441、423和405，提示代谢产物结构中含有一个葡萄糖基和一个木糖基。将对照品20(S)-三七皂苷R2和20(R)-三七皂苷R2进行LC-MS/MS分析，所得到的MS和MS/MS数据及色谱保留时间与代谢产物相比较。分别与代谢产物M1和M2一致，所以这2个代谢产物的结构分别鉴定为20(S)-三七皂苷R2和20(R)-三七皂苷R2。
       
       在MS谱中，M3、M4和M7均显示m/z 639 ［M+H］+的准分子离子峰，比三七皂苷R1的m/z 933 ［M+H］+少294 amu，提示均为脱去一分子木糖基和葡萄糖基的代谢产物。在MS/MS谱中上述3个代谢产物均显示了3个主要的碎片离子峰m/z 441、423和405，提示代谢产物结构中含有一个葡萄糖基。分别将对照品20(S)-人参皂苷Rh1、20(R)-人参皂苷Rh1和人参皂苷F1进行LC-MS/MS分析，将MS和MS/MS数据及色谱保留时间与代谢产物相比较。分别与代谢产物M3、M4和M7一致，所以这3个代谢产物的结构分别鉴定为20(S)-人参皂苷Rh1、20(R)-人参皂苷Rh1和人参皂苷F1。
        在MS谱中，代谢产物M5显示m/z 621 ［M+H］+准分子离子峰，比人参皂苷Rh1的m/z 639 ［M+H］+少18 amu，提示为人参皂苷Rh1脱去一分子水的代谢产物。在MS/MS谱中显示了3个主要的碎片离子峰m/z 441、423和405，提示代谢产物结构中含有一个葡萄糖基。将对照品人参皂苷Rh4进行LC-MS/MS分析，将所得的MS和MS/MS数据及色谱保留时间与代谢产物相比较。与代谢产物M5一致，因此代谢产物的结构鉴定为人参皂苷Rh4。
       
       在MS谱中，代谢产物M6显示m/z 477 ［M+H］+准分子离子峰，比三七皂苷R1的m/z 933 ［M+H］+少456 amu，提示为脱去二分子葡萄糖基和一分子木糖基的代谢产物。经与对照品原人参三醇的MS和MS/MS数据相比较，鉴定代谢产物M6的结构为原人参三醇。
        在MS谱中，代谢产物M8显示m/z 753 ［M+H］+准分子离子峰，比三七皂苷R2的m/z 771 ［M+H］+少18 amu，提示为三七皂苷R2脱去一分子水的代谢产物。在MS/MS谱中显示了三个主要的碎片离子峰m/z 441、423和405，提示代谢产物结构中含有一个葡萄糖基。将对照品3β, 12β -二醇达玛烷-E-20(22),24-二烯-6-O-β-D-木糖-(1→2)-β-D-葡萄糖苷进行LC-MS/MS分析，将MS和MS/MS数据与代谢产物相比较。与代谢产物M8一致，所以代谢产物的结构鉴定为3β, 12β -二醇达玛烷-E-20(22),24-二烯-6-O-β-D-木糖-(1→2)-β-D-葡萄糖苷。该化合物为从三七皂苷R1的微生物转化中分离得到的新化合物。
       3 讨论
        人参皂苷并不是完全以原药形式吸收入血，而是通过酸碱水解、肠道菌群代谢或肝脏代谢变成水解物或代谢物，进而产生疗效。故在考察人参皂苷的体外抗菌、抗肿瘤等作用时，不能仅考虑原型药物的作用，还要考虑其在体内是否代谢，代谢产物是否有活性及其活性强弱［8,9］。
        本实验发现大鼠口服三七皂苷R1后，大量的原形药物通过粪便排泄出体外，12 h内能检测到的代谢产物很少，表明三七皂苷R1在体内需要经过肠内菌的代谢，从而导致检测的时限延长。HPLC-ESI-MS/MS检测结果表明三七皂苷R1在大鼠体内代谢的产物主要有8个：20(S)-三七皂苷R2，20(R)-三七皂苷R2、20(S)-人参皂苷Rh1，20(R)-人参皂苷Rh1，人参皂苷Rh4，原人参三醇，人参皂苷F1和3β, 12β -二醇达玛烷-E-20(22),24-二烯-6-O-β-D-木糖-(1→2)-β-D-葡萄糖苷，且与微生物转化的产物基本一致，进一步证明了可以利用微生物转化模型来模拟人参皂苷在人类或动物体内的代谢。
       【参考文献】
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