小百部药材的总皂苷含量与质量标准研究
作者:胡嘉蕴,卢燕,黄永凤,陈道峰
作者单位:复旦大学药学院,上海 200032
《时珍国医国药》 2010年 第2期
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【摘要】
目的建立小百部药材的总皂苷含量测定方法并制订质量标准,为该药材的质量控制提供科学依据。方法以小百部苷B为对照品,浓硫酸∶甲醇(7∶3)为显色剂建立比色法测定小百部的总皂苷含量;采用《中国药典》2005版规定的水分测定法、灰分测定法测定小百部药材的水分、总灰分和酸不溶性灰分。结果小百部苷B在10.6~127.2 μg范围内呈良好的线性关系,r = 0.999 7,平均加样回收率为98.36%,RSD=2.38% (n=6);小百部总皂苷含量为5.96%~7.98%。结论该法操作简便、准确,可用作小百部药材质量评价的定量分析方法。根据测定结果,建议小百部药材总皂苷含量以干燥品计不低于6.0%。
【关键词】 小百部 质量标准 小百部苷B 比色法
Determination of Total Saponins of Asparagus filicinus Root by Colorimetry and its Quality Standard
HU Jiayun, LU Yan, HUANG Yongfeng, CHEN Daofeng
Department of Pharmacognosy, School of Pharmacology, Fudan University, Shanghai 200032,China
Abstract:ObjectiveTo establish a colorimetric method to determine the total saponins of Asparagus filicinus root for quality evaluation. MethodsA colorimetric method was established with aspafilioside B as the chemical reference and a mixture of sulfuric acid and methanol (7:3) as the coloring reagent. The moisture, total ash and acid-insoluble ash were determined according to the methods in Chinese Pharmacopoeia 2005.ResultsThere was a good linearity ( r = 0. 9997) within the range of 10.6~127.2 μg. The average recovery of aspafilioside B was 98.36% with RSD of 2.38%. The contents of total saponins were 5.96% ~7.98%. ConclusionThe newly-developed colorimetric method can be used for the quality control of Asparagus filicinus root. It is proposed to contain not less than 6.0% of saponins calculated with reference to the dried drug.
Key words: Asparagus filicinus; Quality standard; Aspafilioside B; Colorimetry
小百部又名滇百部,为百合科(Liliaceae) 天门冬属(Asparagus) 植物羊齿天门冬Asparagus filicinus Buch.-Ham. ex D.Don的块根,主产于云南和四川,为云南彝族和傣族的习用药物,用于治疗气管炎、肺炎和咳嗽,在云南省的一些地区,也作为中药百部的代用品[1]。2005版《云南省中药饮片标准》收录了“滇百部饮片”和“蜜滇百部”,但均未见定量测定[2]。现代药理学研究表明,小百部具有较强的抗肿瘤活性,超过了同属抗癌药用植物芦笋,是一种具有良好开发前景的天然药物[3]。本课题组前期的化学和药理实验表明,小百部的小百部苷甲、小百部苷B等6个皂苷类化合物对人肺腺癌A-549和乳腺癌MCF-7肿瘤细胞株均有不同程度的生长抑制活性,皂苷类化合物是小百部抗肿瘤作用的主要活性成分[4]。为了更好地开发利用小百部药材,本文建立比色法对10个不同产地和不同收集时间的小百部药材进行了总皂苷含量的测定,同时测定了水分、总灰分和酸不溶性灰分,以期为制订小百部的质量标准提供依据和参考。
1 仪器与试药
756MC紫外分光光度计(上海第三分析仪器厂);SHANGPING FA1004天平(上海天平仪器厂);DHG系列电热恒温鼓风干燥箱(上海华连医疗器械有限公司);马弗炉(上海鼎奇实业有限公司);甲醇、浓硫酸等试剂均为分析纯。对照品小百部苷B由本课题组自制[4],经HPLC-ELSD检测,纯度达98%以上;经鉴定,10个小百部药材均为A. filicinus的干燥根,凭证样本保存于本教研室。
2 方法与结果
2.1 总皂苷含量测定
2.1.1 对照品溶液制备精密称定小百部苷B对照品适量,以甲醇溶解,制成1.06 mg/ml的溶液。
2.1.2 供试品溶液制备精密称取小百部药材粉末0.5 g,用20 ml甲醇超声提取30 min,放冷,用甲醇补足失重,摇匀,过滤,精密吸取续滤液5 ml,蒸去溶剂,精密加入5 ml水,使溶解,过滤,精密吸取续滤液1 ml,加于已处理好的ADS-7大孔树脂柱(玻璃柱,1×30 cm,湿法装柱,树脂床体积为5 ml,用20 ml水预洗,控制流速为15~20滴/ min),先用20 ml水洗至还原糖反应呈阴性,弃去水洗液,再用20 ml甲醇洗脱,收集甲醇洗脱液,50 ℃减压蒸干,用甲醇溶解并定容至2 ml,摇匀,作为供试品溶液。
2.1.3 显色方法及测定波长的选择取对照品溶液和供试品溶液各0.5 ml,挥干溶剂,加入新配制的浓硫酸-甲醇(7∶3) 5 ml,60 ℃水浴中加热60 min,取出,立即置冰水浴中冷却5 min,摇匀,冰水浴中静置10 min,以浓硫酸-甲醇(7∶3)为空白对照,在200~400 nm扫描,结果显示对照品溶液和供试品溶液均在320 nm附近有最大吸收,空白无干扰。因而选定320 nm作为测定波长。
2.1.4 标准曲线的制备
精密吸取对照品溶液10,20,40,60,80,100,120 μl,按“2.1.3”项下方法显色,分别在320 nm处测定吸光度,并做空白对照。以吸光度为纵坐标,对照品质量(μg)为横坐标,绘制标准曲线,求得回归方程为Y= 0.007 9X- 0.125 4,r = 0.999 7,线性范围为10.6~127.2 μg。
2.1.5 稳定性实验取同一供试品溶液,按“2.1.3”项下方法显色,于320 nm每隔20 min测定吸光度,测完立刻放回冰水浴中。结果表明,供试品溶液在冰水浴中2 h内稳定。
2.1.6 精密度实验精密吸取对照品液40 μl,按“2.1.3”项下方法显色,320 nm处重复测定吸光度值6次,求得 RSD值为2.32%(n=6)。
2.1.7 重复性实验取同批小百部药材粉末6份,分别按“2.1.2”项下方法平行制备供试品溶液,按照“2.1.3”项下方法显色,320 nm处测定吸光度值,计算含量,求得RSD值为2.72%(n=6)。
2.1.8 加样回收率测定取“2.1.7”项下所用小百部药材粉末约0.25 g,共6份,用20 ml甲醇超声提取30 min,用甲醇补足失重,摇匀,过滤,精密吸取续滤液5 ml,蒸去溶剂,精密加入5 ml水,过滤,精密吸取续滤液1 ml。另取对照品溶液700 μl,挥干溶剂后加入前述1ml续滤液,溶解后加入已处理好的大孔树脂柱纯化浓缩,按照“2.1.3”项下方法显色,320 nm处测定吸光度值,计算得平均加样回收率为98.36%,RSD 2.38%(n=6)。
2.1.9 含量测定
取不同产地的10批小百部药材粉末0.5 g,精密称定,按“2.1.7”项下方法分别提取测定,计算含量。结果见表1。
2.2 水分、总灰分、酸不溶性灰分的测定
2.2.1 测定方法
水分测定参照《中国药典》2005年版(Ⅰ部)附录ⅨH水分测定法(烘干法);总灰分、酸不溶性灰分测定参照《中国药典》2005年版(Ⅰ部)附录ⅨK灰分测定法 [5]。
2.2.2 测定结果10批样品的水分、总灰分和酸不溶性灰分测定结果见表1。表1 小百部药材的总皂苷含量及各检查项测定结果(略)
3 讨论
本文所研究的小百部又名滇百部[1]。本品首次以“小百部”药材名收载于《云南省药品标准》1974版,明确来源为“百合科植物羊齿天门冬Asparagus filicinus Ham.的去皮干燥块根” [6];在2005版《云南省中药饮片标准》中则以“滇百部饮片”和“蜜滇百部”收录[2]。“小百部”一名亦见于2005版《中国药典》附录,但其来源被定为“百合科植物小天门冬A. pseudofilicinus Wang et Tang的干燥根”[5]。经查,《中国药典》附录收载的“小百部”为成方制剂“雅叫哈顿散”的配伍药材之一,傣药“雅叫哈顿”最早也收载于1974年版《云南省药品标准》,但当时处方中明确列出的是“小天冬”,而不是“小百部”,且明确记载百合科小天冬A. pseudofilicinus Wang et Tang与天门冬A. cochinchinensis(Lour.)Merr.的干燥块根同为药材天门冬的正品来源,与同时收录的小百部(羊齿天门冬A. filicinus Ham.的去皮干燥块根)实为两个不同的药材品种[6]。此外,徐国钧等[7]学者核查后也指出小百部的学名应采用A. filicinus Ham. ex D. Don。综合以上分析,我们认为2005版《中国药典》“雅叫哈顿散”处方及附录中收录的“小百部”一名有误,应更正为“小天冬”。
实际上,小百部药材的名称和基源一直比较混乱。在第2版《中药大辞典》中收录的“小百部”来源为百合科天门冬属植物石刁柏A. officinalis L.的块根,而本文研究的小百部(滇百部)则以其原植物名“羊齿天冬”收录其中[8]。同样以“羊齿天冬”收录的还有《全国中草药汇编》 [9]、《现代中药学大辞典》[10]等。综合实际情况和各文献考虑,我们建议来源于羊齿天门冬块根的药材统一采用“小百部(滇百部)”之名,以示区分。
本课题组前期对小百部化学成分的研究分离得到12个甾体皂苷,体外抗肿瘤活性测试发现,其中的小百部苷甲、小百部苷B等6个化合物对人肺腺癌A-549和乳腺癌MCF-7肿瘤细胞株均有不同程度的生长抑制活性,表明皂苷类化合物是小百部抗肿瘤作用的主要活性成分[4]。另外,本课题组曾建立HPLC-ELSD法测定小百部中小百部苷B的含量,结果显示,不同产地的小百部药材中小百部苷B的含量从0.128%至0.361%不等,含量差异较大;同时发现天门冬药材的HPLC图谱中无小百部苷B峰,选择小百部苷B作为评价小百部药材质量的指标性成分具有一定的专属性[11]。因此,本实验选择抗肿瘤活性较好的小百部苷B为对照品,建立比色法测定小百部药材的总皂苷含量,作为评价小百部药材质量的参考依据。
对供试品溶液的制备方法,我们分别考察了提取溶剂(甲醇、50%乙醇)、提取溶剂用量(10,20,30 ml)、提取方式(超声,加热回流、渗漉)、提取时间(20,30,40 min),最后确定甲醇20 ml超声30 min可提取完全且操作简便易行。同时对纯化方式也进行了考察,主要比较了正丁醇萃取和大孔树脂纯化法,测得的总皂苷含量分别为4.96%和6.02%(云南曲靖2003-09收集样品),另外正丁醇萃取法存在操作繁琐、气味难闻等缺点,而大孔吸附树脂具有吸附容量大、选择性好、易解吸、效率高等优点[12],且加样回收率实验结果满意,故采用大孔树脂作为纯化方式。
含量测定结果表明,不同产地的小百部药材的总皂苷含量为5.96%~7.98%,与HPLC-ELSD法测定小百部中小百部苷B的含量结果 [11]相比,总皂苷含量相对稳定,且考虑到小百部的多个皂苷类成分均具有抗肿瘤活性,因此,以总皂苷含量来控制小百部药材的质量更为合理。根据本实验的测定结果,我们建议小百部药材的总皂苷含量以小百部苷B计不少于5.0%;如果以干燥品计,总皂苷含量不少于6.0%。
水分、总灰分和酸不溶性灰分的测定结果显示,小百部药材的水分含量为6.29%~9.50%,水分较高,总皂苷含量应以干燥品计算较为合理;总灰分含量3.22%~4.38%,各批次间差异不显著;酸不溶性灰分含量较低,从0.110%~0.510%不等。依据上述结果,建议水分不超过10.0%,总灰分不超过5.0%,酸不溶性灰分不得超过1.0%。此研究结果可作为制定小百部药材质量标准的参考依据。
【参考文献】
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