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       【摘要】 
       目的优选胡黄连稳定的ISSR-RCR反应体系。方法采用4因素（dNTRs、Mg2+、Taq酶、引物）4水平的正交实验和单因子梯度优化相结合的方法。结果适于胡黄连的25μl ISSR-PCR反应体系中各因素最佳浓度分别为10×buffer 2.5 μl,dNTPs 150μmol/L,Mg2+1.5mmol/L,Taq酶1U，引物0.5 μmol/L，DNA 20 ng或10×buffer 2.5 μl,dNTPs 150μmol/L,Mg2+2 mmol/L,Taq酶0.5 U,引物0.4 μmol/L，DNA 20 ng。结论对于胡黄连ISSR-RCR试验，一次正交实验完全可以建立起满足要求的PCR体系。
       【关键词】  胡黄连　正交实验　单因子　ISSR-PCR
       Establishment and Optimization of ISSR PCR Reaction System for Medicinal Plant Neopicrorhiza scrophulariiflora
       LIU Xiaoli, PU Chunxia, YANG Yaowen, QIAN Zigang
       1.Department of Chinese Materia Medica, Yunnan College of Traditional Chinese Medicine，Kunming, 650500, China; 2.College of Life Science, Yunnan University, Kunming, 650091 China
       Abstract：ObjectiveTo optimize the stable ISSR reaction system for Neopicrorhiza scrophulariiflora.MethodsConcentration of dNTPs,Mg2+,Taq DNA polymerase and primers were studied by orthogonal experiment combined with single factor experiment.ResultsThe optimal ISSR-PCR reaction system(25μl) was as follows:10×buffer 2.5 μl,dNTPs150 μmol/L,Mg2+1.5mmol/L,Taq DNA polymerase 1U,primers 0.5 μmol/L,DNA 20 ng or 10×buffer 2.5 μl,dNTPs 150 μmol/L,Mg2+ 2mmol/L,Taq DNA polymerase 0.5U,primers 0.4 μmol/L,DNA 20 ng.ConclusionFor Neopicrorhiza scrophulariiflora,one orthogonal experiment can establish satisfactory PCR system.
       Key words:Neopicrorhiza scrophulariiflora ;  Orthogonal experiment ;  Single factor experiment;  ISSR-PCR
        ISSR是Zietkewicz等［1］1994创建的一种在SSR的3′或5′端锚定单寡聚核苷酸的引物对基因组DNA进行PCR扩增的标记系统，类似于RAPD，但引物比RAPD的引物长，退火温度更高，因此ISSR具有比RAPD更高的重复性和稳定性，加上每个引物可以揭示比RAPD更多的多态位点［2］,因此，ISSR在居群的遗传多样性研究中是一种非常理想的分子标记［3］。运用ISSR标记技术时，不同的反应体系可产生不同的结果，为了确保ISSR分析结果的可靠性和重复性，进行ISSR-PCR反应体系的优化非常必要。
        胡黄连Neopicrorhiza scrophulariiflora Pennell (Hong)为玄参科（Scrophulariaceae）胡黄连属（Neopicrorhiza）的多年生草本植物，本属仅此一种，为濒危物种，国家三级保护植物［4］。胡黄连的根状茎入药后为重要药材胡黄连，具有清湿热、除骨蒸、消疳热的功效［5］。以往对胡黄连的研究主要在化学［6～10］和药理［11～15］方面，未见其保护遗传学方面的报道。
        本实验采用西藏定日县胡黄连基因组DNA为模板,通过正交设计实验初步建立适宜ISSR -PCR反应体系,再对初选的反应体系中各个因子设置浓度梯度，建立适合胡黄连ISSR-PCR的最佳反应体系，为胡黄连进一步的保护遗传学研究奠定基础。
       1  材料
        采集于西藏定日县(海拔4 050～4 300 m,凭证标本保存于云南中医学院中药学院)的胡黄连幼嫩叶片，硅胶干燥后保存于-20℃冰箱中。ISSR引物参照加拿大哥伦比亚大学(UBC)提供的序列由上海生物工程公司合成。PCR反应相关试剂购自大连宝生物工程有限公司，PCR反应在Biometra PCR仪上进行。
       2  方法
       2.1  基因组DNA提取与检测采用CTAB法，略加改良。1%琼脂糖凝胶电泳检测片段大小，总DNA用无菌双蒸水稀释到10 ng/μl，-20℃冰箱保存。
       2.2  正交实验初选反应体系本研究参考豇豆［16］、玄参［17］、石斛［18］、永瓣藤［19］、黄连［20］的ISSR反应条件，初步确定dNTPs、Taq酶、Mg2+、引物浓度各4个水平（见表1），按照L16（4）正交表形成16个组合的实验方案（见表2）。表1  用于胡黄连1SSR-PCR正交实验的4因子4水平（略）
       2.3  单因子梯度实验本研究在正交实验所初选的PCR反应体系的基础上，对单个因子又设置了一定的梯度，以进一步优化所初选的反应体系，并比较单因子浓度对反应体系的影响。PCR总体积为25 μl，其中dNTPs设置了0.1，0.125，0.15，0.175，0.2 mmol/L 5个浓度梯度；Mg2+设置了1，1.25，1.5，1.75，2 mmol/L 5个浓度梯度；Taq DNA酶设置了0.5，0.75，1，1.25，1.5，2 U 6个浓度梯度；引物设置了0.3，0.35，0.4，0.45，0.5 μmol/L 5个浓度梯度；模板设立了10，20，30，40，50，100 ng   6个浓度梯度。
       2.4  PCR 扩增与产物检测反应通过引物筛选后，选用引物856（序列为5"-3" ACA CAC ACA CAC ACA CYA）为ISSR-PCR 反应体系优化的引物。反应体系为25 μl,内含10×PCR buffer 2.5 μl, DNA20 ng, 其余成分按照表2进行。反应程序: 94℃预变性5 min, 94℃变性1 min, 55℃退火1 min , 72℃延伸2 min，循环35次，72℃延伸5 min，4℃保存。PCR产物均在含溴化乙锭的1.5%琼脂糖凝胶中，以0.5×TBE为电泳缓冲液电泳分离，最后用紫外成像系统(Tanon GIS-2009)观察并成像。
       3  结果
       3.1  正交实验结果正交实验结果从图1直观可见，16个组合中除了9号和13号以外，均有扩增产物，但1，2，3，4，7，8，14，15，16号所扩增的条带较弱，无法统计，予以淘汰。5，6，10，11，12号均扩增出了清晰的条带，且条带数较多，但10，11，12号非特异性扩增严重，图谱背景模糊，亦予以淘汰。5，6号扩增条带相似，均为6条亮度适中、分离较好的条带。综上所述，本研究确定5号和6号为最理想的反应体系。表2  胡黄连ISSR - PCR L16（4）正交实验各组合（略）
       3.2  单因子浓度梯度下扩增产物比较在对dNTPs、Mg2+、引物、Taq酶、模板5个因子进行了梯度对比后发现，各个因子的浓度均在较大的范围内对扩增产物不造成显著影响。dNTPs是PCR的原料，浓度太高容易产生错误掺入，浓度太低产率太低，常用的是0.05～0.2 mmol/L［21］。本实验发现胡黄连PCR扩增中100～300 mmol/L的dNTPs均产生了一致的扩增条带。Mg2+在1～2 mmol/L浓度内均扩增出了6条带，只是在低浓度（1～1.5 mmol/L）下扩增谱带的清晰度较之高浓度（1.75和2 mmol/L）条件下略差。引物的浓度会影响PCR扩增的特异性,在胡黄连的ISSR-PCR扩增中引物浓度在5个浓度下（0.3～0.5 μmol/L）的扩增谱带无显著差异。对大多数物种来说Taq酶浓度变化对实验结果影响较大，酶用量过高会造成非特异扩增，过低则会降低产物合成效，在本实验25 μl的反应体系中，从0.5 U到2 U的范围内扩增条带基本一致，且0.5U下扩增图谱清晰、条带强。一般认为模板浓度对反应体系的影响不大，本试验亦证明了这一点，在25 μl的反应体系中，模板量在10～50 ng的范围内，扩增图谱完全一致，而模板量为100 ng时，条带少而模糊。
       4  讨论
        基于PCR-ISSR分子标记的研究，反应体系的建立是第一步，这关系着后续的试验能否顺利进行并获得理想的结果。多数学者倾向于直接采用单因子梯度试验来优化体系，笔者开始时亦采取了此法，但发现PCR反应条件与成分之间的组合有关，靠单因子优化步骤繁琐，难以快速地优化出适宜的体系。
       
       本实验采用一次正交设计初选出可扩增出条带的PCR反应体系，然后再结合单因子梯度试验进一步优化反应体系，最后确定适合胡黄连的稳定的ISSR-PCR反应体系。实验表明，在正交初选的体系基础上，改变各个因子浓度，在较大浓度范围内对PCR结果影响均不大。因此，胡黄连PCR体系完全可采用正交试验初选出来的体系即为：25 μl 反应体系10×buffer 2.5 μl,dNTPs150 μmol/L,Mg2+1.5 mmol/L,Taq酶1 U,引物0.5 μmol/L，DNA 20 ng或10×buffer 2.5 μl,dNTPs150 μmol/L,Mg2+2 mmol/L,Taq酶0.5 U,引物0.4 μmol/L，DNA 20 ng。本实验的结果也可为其它物种基于ISSR分子标记的相关研究提供借鉴和参考。
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