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       【摘要】 
       目的通过自拟方抑制癌汤对人肺癌NCI-H446细胞株进行干扰研究，探讨其增殖抑制作用。希望从苗药中药组方中找到抑制肺癌细胞增殖的新方法。方法将NCI-H446细胞进行培养，绘制NCI-H446细胞生长曲线，取处在对数生长期的NCI-H446细胞进行实验。首先确定抑癌汤的作用浓度范围。取细胞的存活率为50%时的药物浓度范围作为抑癌汤的给药浓度参考。再将抑癌汤在该浓度范围内分为5个浓度组；实验分抑癌汤组、西药组、抑癌汤加西药组、空白组四组、每一组各4个复孔，进行对照研究。结果抑癌汤对NCI-H446细胞毒实验得到细胞存活率50%时的药物浓度范围在1～100 μg/ml之间。抑癌汤加西药组优于抑癌汤组；抑癌汤加西药组优于西药组；西药组优于抑癌汤组；抑癌汤组优于空白组；抑癌汤加西药组优于空白组；西药组优于空白组。结论抑癌汤在体外对人肺小细胞肺癌NCI-H446细胞具有抑制作用，具有潜在药用价值，值得进一步深入研究。
       【关键词】  自拟方　抑癌汤　 肺癌　 NCI-H446细胞株　 增殖抑制作用
        原发性支气管肺癌（primary bronchogenic carcinoma）肿瘤细胞起源于支气管粘膜或腺体，是最常见的肺部原发性恶性肿瘤。目前肺癌中医治疗主要用于以下几个方面：①对于分化较好的非小细胞肺癌不能手术或术后、放疗后复发者，单用中医药治疗可获比放、化疗较好的效果；②配合手术、放化疗，起到减毒增效作用，即减少毒副反应，提高疗效；③晚期肺癌西医无特殊治疗者，应用中医药可改善症状，提高生存质量，延长生存期，并在抗复发转移方面有一定的优势。苗族医药是苗族人民在长期生产和生活实践中与疾病作斗争的经验总结和智慧结晶。苗医药认为癌是由于致癌恶毒引起细胞异常增生和变性的恶毒病症。为了从中药、民族药中寻找能抑制肺癌肿瘤细胞增殖的药物，我们开展由中药、苗药组成的抑癌汤对人肺癌NCI-H446细胞株进行干扰研究。现报道如下。
       1  材料
       1.1  苗药中药处方八月扎20 g，白花蛇舌草20 g，半枝莲20 g，三尖杉20 g，白英20 g，石见穿20 g 。 
       1.2  阳性对照药物金喜素（注射用盐酸托泊替康）， 贵州汉方制药有限公司，批准文号：国药准字H20000428   规格：2 mg/瓶。
       1.3  人肺小细胞肺癌NCI-H446细胞株人肺小细胞肺癌NCI-H446细胞株购买于南京凯基生物科技发展有限公司， 培养要求：贴壁培养：
       
       培养基：RPMI-1640 +10%小牛血清+1%双抗
        消化液：0.25%胰蛋白酶
        冻存液：胎牛血清：DMSO=9：1
        培养条件：二氧化碳培养箱：5%CO2，37℃
       2  方法
       2.1  给药方法
       2.1.1  苗药中药组方煎煮和灭菌方法首先将待煎的药物用冷水浸泡30    min，加水以浸泡后淹没药材2～3 cm为度。称取药物重量约120 g，使用砂锅煎煮。煎煮用武火煎至微沸，再用文火煎煮，煎煮时间是以文火煎煮时间考察的，煎煮30 min。为了充分利用药材，避免浪费，更好发挥药效，煎煮两次。煎煮时应当注意搅拌。再将两次煎煮好的汤药倒在一起，进行浓缩。将浓缩好的抑癌汤经过纱布、滤纸过滤，得到汤药约120 ml。即得到抑癌汤生药浓度为1g/ml。再经过高压消毒锅灭菌，4℃冰箱存放备用。
       2.1.2  金喜素（注射用盐酸托泊替康）人体每日用量：1.2 mg/m2
       2.2  人肺小细胞肺癌NCI-H446细胞的培养
       2.2.1  细胞鉴定对收到的细胞株进行鉴定，由专职病理老师在倒置显微镜下观察鉴定，并结合南京凯基生物科技发展有限公司提供的细胞资料，鉴定为NCI-H446细胞株。
        细胞株收到后，细胞培养瓶完好无损，培养液无外渗，培养液无混浊。在倒置显微镜下观察细胞密度，汇合度约为60%，未达到细胞传代要求的汇合度80%的要求，将培养瓶中培养液吸出，留10 ml培养液继续培养，细胞形态呈现圆形或梭性。过了2 d后细胞汇合度超过80%后，按细胞传代要求进行传代。
       
       细胞高度恶性，未分化。癌细胞体积小，核圆形和卵圆形，癌细胞胞浆少，核浆比例明显增大，核外形不规则，核分裂多见，癌细胞界限不清。
       2.2.2  细胞传代继续培养细胞，直到细胞汇合度达到细胞传代为80%的要求时，进行细胞传代。在NCI-H446细胞瓶内加入0.25%胰蛋白酶，消化3～6 min，加入培养基吹打，制作成细胞悬液按1∶2传代。
        按细胞培养条件进行传代，经过3次传代培养后，细胞一共有8瓶。细胞形态呈现圆形或梭性，将其中4瓶冻存。将2瓶用于后续实验，另外2瓶继续传代培养。
       2.3  细胞生长曲线绘制
       2.3.1  细胞加样计算细胞浓度2次，得出细胞浓度平均值。然后将细胞悬液等量的加入培养板的每个孔中，每天观察4个孔，培养时间计为7 d。
       2.3.2  观察指标每隔24 h吸去4个孔的培养液，加入消化液，混悬细胞，计数细胞数目。每个孔计数2次，得出细胞浓度平均值。
       2.3.3  绘制细胞生长曲线横坐标为培养时间，纵坐标为细胞浓度，绘制细胞生长曲线。细胞倍增时间约为26 h。结果见图1。
       2.4  细胞增殖抑制实验
       2.4.1  细胞加样取对数生长期的细胞，将细胞制成细胞悬液，再将细胞悬液加入细胞计数板进行计数，配制为5 000个/ml细胞浓度，将其接种细胞培养板。96孔细胞培养板每孔100 μl，放入37℃，5%CO2培养箱继续培养。
       2.4.2  加药方法细胞加样后经过24 h培养，从二氧化碳培养箱中取出96孔细胞培养板，在通过倒置显微镜观察细胞形态，确定细胞生长良好后，按实验分组用取样器每孔加入相应液体各5 μl。每组4个复孔。
       2.4.3  检测方法再经过24 h培养后，在96孔细胞培养板中加入MTT溶液10 μl,继续培养4 h。吸去培养液，加入与培养液相同量的DMSO。然后振荡10 min，使结晶充分溶解。在酶联免疫检测仪上测定光吸收值。
       2.4.4  实验分组根据抑癌汤细胞毒实验求出的抑癌汤IC50值，得出抑癌汤的IC50值所在的给药浓度范围。本实验IC50值所在的给药浓度范围在1～100 μg/ml之间。因此实验分组如下：
        抑癌汤组：取抑癌汤组的中间浓度（60 μg/ml）；
       
       抑癌汤加西药组：取抑癌汤组的中间浓度（60μg/ml）并加用西药；
        
       2.4.5  观察指标 在酶标仪上测定光吸收值，测定波长为490 nm，测定OD数值。并进行形态学观察。
       2.4.6  绘制细胞增殖抑制实验图表细胞存活率（%）=实验组光吸收值/对照组光吸收值×100%，对照组为只加等量的细胞培养液而不加任何药物。细胞增殖抑制率（%）=(1-细胞存活率)×100%。以时间为横轴，以细胞增殖抑制率为纵轴，绘制细胞增殖抑制实验图表。
       2.5  实验条件控制全部实验在遵义医学院中心实验室完成，细胞培养及相关检测在其细胞培养室完成。
       2.6  统计学处理方法方差分析两两差异比较用LSD-t检验［2］，两者间比较用均数比较。统计学软件应用Microsoft Excel2000进行统计分析。
       3  结果
       3.1  不同浓度抑癌汤对NCI-H446细胞的增殖抑制作用人小细胞肺癌NCI-H446细胞在20，40，60，80，100 μg/ml的5个浓度上，癌细胞呈现出相应的变化：即随着抑癌汤药物浓度的增高癌细胞数量明显减少。NCI-H446细胞在低浓度20 μg/ml时，细胞数量最多癌细胞被相互积压而呈现出变形状态。NCI-H446细胞在较高浓度80 μg/ml时，癌细胞呈卵圆形，梭形；核大、胞浆少；核仁不明显，核分裂不明显。NCI-H446细胞在较高浓度100 μg/ml时，细胞数量继续减少，癌细胞呈结构不清。
       3.2  同浓度抑癌汤对NCI-H446细胞的增殖抑制率
        抑癌汤在20，40，60，80，100 μg/ml各浓度和在24，48，72 h这3个观测时间点与空白组（培养基对照组）比较均有统计学差异。
       
       抑癌汤组3次重复实验经过统计分析得到：P=0.492，即抑癌汤组3次重复实验无统计学差异，说明实验具有可重复性。结果显示不同浓度抑癌汤作用48 h对NCI-H446细胞的增殖具有明显的抑制作用，随着作用时间的延长抑制作用逐渐减弱，且随着给药剂量的增大，抑制作用增强。抑癌汤在24 ，48，72  h的抑制率分别达到53.47%，54.47%和10.45%。3次实验的抑癌汤的最高抑制率分别达到54.47%，53.2%和46%。表1   抑癌汤对NCI-H446细胞的增殖抑制作用(略)表2   给药组抑制率数据(略)
       3.3   四个给药组（抑癌汤组、抑癌汤加西药组、西药组、空白组）之间的比较
       3.3.1  细胞形态学观察抑癌汤组选用的中间浓度（60 μg/ml）。人小细胞肺癌NCI-H446细胞在4种不同给药方式作用下呈现不同细胞形态。其中抑癌汤加西药组在48 h观察点上效果最明显，细胞核完全固缩，核溶解，细胞轮廓难以辨认；其次是西药组，细胞呈现出细胞核固缩，核溶解，细胞轮廓勉强可以辨认；再次是中药组，细胞呈现出偶尔有细胞核固缩，细胞轮廓清楚，细胞数量最多癌细胞被相互积压而呈现出变形状态，癌细胞呈卵圆形，梭形但不规整；空白出细胞存活状态良好，核大、胞浆少；核仁不明显，核分裂活跃，只是偶尔有衰老细胞增多。
       3.3.2  不同给药方式对NCI-H446细胞的增殖抑制率
        抑癌汤组选用的中间浓度（60 μg/ml）。抑癌汤加西药组与抑癌汤组；抑癌汤加西药组与西药组；抑癌汤组与西药组；抑癌汤组与空白组；抑癌汤加西药组与空白组；西药组和空白组的细胞抑制率有统计学差异。
        通过给药组间均数两两比较：抑癌汤加西药组优于抑癌汤组；抑癌汤加西药组优于西药组；西药组优于抑癌汤组；抑癌汤组优于空白组；抑癌汤加西药组优于空白组；西药组优于空白组并有统计学差异。
       4  讨论
        原发性支气管肺癌（primary bronchogenic carcinoma）简称肺癌（lung cancer）。肿瘤细胞起源于支气管粘膜或腺体，是最常见的肺部原发性恶性肿瘤［3］。在我国城市人口中，肺癌的死亡率已由第四位跃居为各种肿瘤的首位，农村中上升最快的也是肺癌。肺癌的历史只有五百余年。1420年在德国萨克森的一座矿山发现了首例肺癌。1875年在痰中首次见到癌细胞［4］。有专家预言：如果不能有效地控制吸烟和空气污染，到2025年我国每年的肺癌人数将超过100万，成为世界第一肺癌大国［5］。就临床角度而言，肺癌可分为两类：即小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)和非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)。其中小细胞肺癌大约占肺癌的25%。由于癌组织迅速扩散，绝大多数患者失去外科手术切除的机会，临床过程一般不超过3个月。而肿瘤细胞的特征之一是异常增殖，抑制肿瘤细胞的增殖是治疗肿瘤的途径之一，也是抗肿瘤药物的基本要求。
        在祖国医学中虽然无肺癌这一病名，但文献中描述的“肺积”的临床表现与肺癌较为相似，可以归于“咳嗽”“痰饮”“肺积”“咯血”等病证的范畴。其主要的临床表现：上气咳嗽，喘促胸痛，咳痰咯血，胸闷气急，发热口干，气短乏力，腰酸腿软，畏寒怕冷［6］ 。随着中医学理论的日臻完善和临床经验的不断积累，现已逐渐探索并形成了一门新的医学学科——具有较为完整理论体系和辨证论治规范的中医肿瘤学［7］。目前肺癌中医治疗主要用于以下几个方面：①对于分化较好的非小细胞肺癌不能手术或术后、放疗后复发者，单用中医药治疗可获比放、化疗较好的效果；②配合手术、放化疗，起到减毒增效作用，即减少毒副反应，提高疗效；③晚期肺癌西医无特殊治疗者，应用中医药可改善症状，提高生存质量，延长生存期［8］ ，并在抗复发转移方面有一定的优势［6］ 。
       【参考文献】
         　　［1］章静波.组织和细胞培养培养技术［M］.北京:人民卫生出版社,2002：111.
       
       ［2］刘刚.Excel在统计分析中的应用［M］.北京：人民卫生出版社，2002：170.
       
       ［3］熊 敏,吴一龙.现代肺癌病理与临床［M］.北京:科学出版社,医学出版分社,2003：86.
       
       ［4］王吉耀.内科学［M］.北京:人民卫生出版社,2005：112.
       
       ［5］徐振晔,杨宇飞.肺癌中西医综合治疗［M］.北京:人民卫生出版社,2002：2.
       
       ［6］陈锐深.现代中医肿瘤学［M］.北京:人民卫生出版社,2003：1，3.
       
       ［7］王永炎.中医内科学［M］.上海:上海科学技术出版社,1997：91.
       
       ［8］辛 海.肺癌的中医临床治疗进展［J］.Beijing Journal of TCM，2003，22（6）：50.