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       【摘要】 
       目的探讨原花青素(procyanidin,PC)对脑缺血再灌注损伤大鼠Caspase3和Caspase9活性的影响。方法将大鼠随机分为假手术组、缺血再灌注组、PC低剂量治疗组和PC高剂量治疗组，线栓法建立局灶性脑缺血再灌注模型。采用四肽酶底物法检测脑缺血90 min再灌注24 h大鼠Caspase3和Caspase9活性，进行神经症状评分，2，3，5－三苯基氯化四氮唑（TTC）染色和HE染色观察脑梗塞体积及病理形态学变化。结果脑缺血再灌注24 h，缺血再灌注组Caspase3和Caspase9活性增加，与假手术组比较，差异具有显著性（均P<0.05）；与缺血再灌注组比较，PC高、低剂量治疗组均显著减少Caspase3和Caspase9活性，高、低剂量组之间差异亦具有显著性（P<0.05）。PC高、低剂量治疗组神经功能缺失评分较缺血再灌注组降低（P<0.05）。PC高、低剂量治疗组脑梗死体积较缺血再灌注组减小，高、低剂量组之间差异具有显著性（P<0.05）。PC高、低剂量治疗组脑组织缺血损伤病理学改变明显轻于缺血再灌注组，PC高剂量治疗组缺血改变亦轻于低剂量治疗组。结论 PC对缺血再灌注脑损伤具有保护作用，其机制可能与减少Caspase3和Caspase9活性，抗凋亡有关。
       【关键词】  缺血再灌注　 Caspase3　Caspase9　 原花青素
       Effect of  Procyanidin on  the Activities of Caspase -3 and Caspase-9 after Cerebral Ischemic Reperfusion Injury in Rats
       LI Hao，SHI Shenglian，WU Lang，BI Guinan
       The Affiliated Hospital of Guilin Medical College,Guilin 541002,China；2.The First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University,Nanning 530021,China
       
       Abstract：ObjectiveTo study the effect of procyanidin on  the activities of Caspase -3 and Caspase-9  after cerebral ischemic reperfusion（I/R） injury in rats. MethodsIn this experiment, rats were randomly divided into 4 groups:sham operated group, I/R group,low procyanidin treated group and high procyanidin treated group.  The focal middle cerebral artery occlusion(MCAO) model was made by suture-occluded method. After 90min MCAO following 24h  reperfusion,we investigated the activities of Caspase -3 and Caspase-9 with using cleavage of the fluorescence substrate AC-DEVD-AMC and AC-L EHD-AFC respectively. The neurological score was investigated.TTC and HE staining were also investigated. Results Compared with sham operated group , the activities of Caspase -3 and Caspase-9 were increased at 24h reperfusion in the ischemic territory(P<0.05).Compared with I/R group, low and high dose procyanidin dose-dependently  reduced the activities of Caspase -3 and Caspase-9 dose-dependently (P<0.05). The neurological score, and cerebral infarction volume alleviated the pothological changes of brain tissue.ConclusionProcyanidin plays protective effect on cerebral ischemia injury by decreasing the activities of Caspase -3 and Caspase-9,and  then decreasing neuronal apoptosis.
       Key words： Ischemia-reperfusion;   Caspase-3；  Caspase-9;   Procyanidin
        脑缺血再灌注损伤的诸多机制中，凋亡机制是重要一环。原花青素（procyanidin， PC）是一类植物和食品中广泛存在的多酚化合物的总称， 由不同数量的儿茶素和表儿茶素缩和而成，其含大量活性酚羟基使其具有很强的抗氧化及清除各种活性氧自由基的能力［1］。黄晓瑾等［2］给予缺血再灌注大鼠PC治疗，显示PC对缺血再灌注脑损伤有保护作用，但是否对缺血再灌注脑损伤细胞凋亡有影响尚未见报道。本实验采用大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，研究PC对大鼠脑缺血再灌注损伤凋亡基因Caspase -3和Caspase -9活性影响，探讨其保护作用的可能分子生物学机制。
       1  材料
       1.1  动物分组健康Wistar大鼠，雄性，清洁级，共80只，体质量（250±30）g，广西医科大学动物实验中心提供。按随机分组原则分成假手术组（20只）、缺血再灌注组（20只）、PC低剂量治疗组（20只）及PC高剂量治疗组（20只）。
       1.2  给药途径与药量PC低（50 mg/kg）、高剂量（200 mg/kg）治疗组于术前给予灌胃，1次/d，连续1周，于术前1 h再灌胃1次。假手术组和缺血再灌注组给予等量的生理盐水灌胃。
       2  方法
       2.1  动物模型的建立参照Longa等［3］方法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型。采用颈外动脉插入线栓法，进行左侧大脑中动脉栓塞。线栓采用石蜡线栓，线栓直径约0.27 mm，插入深度约18 mm，此时线栓头位于大脑中动脉起始部。假手术组插入线栓长度约10 mm，其余步骤相同。缺血90 min时，抽提线栓实现再灌注。神经功能缺陷评分：按照 Longa等［3］评分标准，各组分别在再灌注24 h进行评分。正常，无神经学征象为0分；动物不能完全神展右前肢为1分；动物右侧肢体瘫痪，行走时向右侧转圈，出现追尾现象为2分；动物行走向右侧跌倒，或动物不能站立或动物打滚为3分；无自发活动，有意识障碍为4分。神经功能缺陷评分在1～3分为模型成功。
       2.2  Caspase3和Caspase9活性检测再灌注24 h，各组随机取10只大鼠，断头取脑,在冰盘上快速分离出左侧大脑皮层,制作脑组织匀浆。取脑组织匀浆100 μl及Caspase-3 底物AC-DEVD-AMC 10 μl (美国Livermore 公司) ,加入HEPES 缓冲液至1 ml ,37 ℃孵育1 h。用荧光分光光度计在激发波长380 nm ,释放波长460 nm 处测定样本荧光强度,间接反应Caspase-3 活性。同理取脑组织匀浆100 μl和Caspase-9 底物AC-LEHD-AFC10μl(美国Livermore 公司) 加入HEPES 缓冲液至1 ml,37 ℃孵育1 h ;使用荧光分光光度计在激发波长400 nm 及发射波长505 nm 时测定其荧光强度即可间接反应Caspase-9活性（各组参照值为未加脑组织时的荧光强度) 。
       2.3  TTC染色再灌注24 h，各组取5只大鼠深麻后开颅取脑。将鼠脑置于-4℃冰箱20 min后，将其切成5等份冠状位切片，置于2%TTC溶液中，水浴、多聚甲醛液固定。用计算机病理图像分析仪及梯形法计算出梗塞灶体积，各脑片梗塞灶体积之和即为梗塞体积。左侧大脑半球梗塞灶区呈白色，主要为额顶部皮质和尾壳核，正常组织呈红色。部分组织表现为由白色向红色过度区。
       2.4  HE染色再灌注24 h，各组随机取5只大鼠，深麻后用生理盐水和多聚甲醛进行心脏灌流固定，断头取脑。在左侧大脑半球距离嗅球尖端7～11 mm之间冠状切取约5 mm厚脑组织块，固定、脱水、包埋成蜡块，连续切片，厚5 μm，常规行HE染色，观察病理形态学改变。
       2.5  统计学方法数据处理采用SPSS11.5统计软件进行运算，结果以±s表示，组间差异显著性检验采用方差分析。
       3  结果
       3.1  PC对Caspase-3和Caspase-9活性的影响见表1。表1  PC对脑缺血再灌注损伤大鼠Caspase-3、Caspase-9和脑梗塞体积的影响(略)
        假手术组Caspase-3和Caspase-9主要以无活性的酶原形式存在。缺血再灌注组Caspase-3和Caspase-9活性升高，与假手术组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。与缺血再灌注组比较，PC高、低剂量治疗组的Caspase-3和Caspase-9活性明显降低，差异有统计学意义(P＜0.05)，高、低剂量组之间差异亦具有显著性（P<0.05）。
       3.2  PC 对神经功能评分的影响见表2。表2  PC对脑缺血再灌注损伤大鼠神经功能评分的影响(略)
       
       假手术组无神经功能缺陷。与假手术组比较, 缺血再灌注组神经功能评分明显增加(P＜0.05) ，PC高、低剂量治疗组大鼠的神经功能评分低于缺血再灌注组(P＜0.05) ，高、低剂量组之间差异无显著性（P>0.05）。
       3.3  PC对脑梗死体积的影响
       PC高、低剂量治疗组梗死体积较缺血再灌注组减小（均P<0.05），高、低剂量组之间差异亦具有显著性（P<0.05）。TTC染色后，缺血再灌注24h左侧大脑半球梗死灶区呈白色，主要为额顶部皮质和尾壳核，正常组织呈红色。部分组织表现为由白色向红色过度区。见图1。
       3.4  各组缺血侧脑组织病理学改变的比较
       假手术组脑组织切片可见神经细胞、胶质细胞及毛细血管形态正常，结构完整，锥体细胞核大而圆，核仁明显（图2）。缺血再灌注组呈缺血改变，梗死区正常组织结构消失，结构不清，间质水肿，有炎细胞浸润；锥体细胞体积缩小，细胞核固缩深染，胞浆嗜伊红。部分细胞坏死，并可见呈筛状坏死的坏死灶（图3）。PC不同剂量治疗组脑组织缺血改变较缺血再灌注组明显减轻，坏死范围缩小，细胞结构较完整，细胞核固缩少，细胞间质水肿轻，高剂量组与低剂量组之间比较，缺血改变更轻（图4～5）。
       4  讨论
        研究表明，脑缺血后神经元的死亡主要表现为坏死和凋亡两种形式。细胞凋亡是在生理和病理条件下的一种主动死亡方式，是受细胞内、外因子调控的生物学过程。在脑缺血急性期，神经元坏死与凋亡并存，细胞坏死位于缺血中心区，细胞凋亡主要出现在缺血半暗带。目前研究发现，脑缺血神经元凋亡受多种基因调控。天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白激酶家族(Caspases)是细胞凋亡过程中最重要的蛋白酶，凋亡的最后实施是通过Caspases的激活而实现的。目前认为Caspases 激活途径主要有3条，线粒体途径为其一。线粒体是对缺血缺氧极其敏感器官，脑缺氧缺血时线粒体膜损伤可致线粒体膜孔，持续开放，细胞色素C由线粒体释放出来后与凋亡蛋白激活因子-1(Apaf-1)、dATP、前Caspase-9形成凋亡复合体激活Caspase-9，并进而激活下游Caspase-3。而Caspase-3是Caspases级联反应中下行的最关键的凋亡执行蛋白酶，在各种程序启动的凋亡程序中起最后枢纽的作用［4］，它的激活可通过裂解DNA依赖性蛋白激酶等，改变其结构，促使细胞凋亡［5］。本研究表明，脑缺血再灌注24 h， Caspase-3和Caspase-9活性显著增强,提示二者参与了再灌注早期脑组织急性损伤，表明再灌注后缺血半暗带细胞凋亡反应增加，与笔者前期研究相一致［6］。
        黄晓瑾等［2］给予脑缺血再灌注大鼠PC治疗，显示PC对缺血再灌注脑损伤有保护作用。本实验结果也表明，脑缺血再灌注损伤大鼠给予不同剂量的PC治疗可明显减轻大鼠神经功能缺失症状，并能减少脑梗塞体积，高剂量PC的保护效果更显著。近年来发现，PC具有抑制核转录因子表达及抗脂质过氧化的作用［7，8］。本研究通过给予PC治疗脑缺血再灌注损伤大鼠，显示PC能显著降低Caspase-3和Caspase-9活性，表明再灌注损伤后，由于血脑屏障通透性的改变，PC进入损伤脑组织，通过降低Caspase-3和Caspase-9活性，减轻神经细胞凋亡反应的发生，发挥脑保护作用，并且高剂量PC对Caspase-3和Caspase-9活性抑制作用更显著。
       【参考文献】
         　　［1］Facino RM, Carini M, Aldini G, et al. Diet enriched with procyanidins enhances antioxidants activity and reduces myocardial post-ischaemic damage in rats［J］. Life Sci, 1999, 64 :627.
       
       ［2］黄晓瑾，毛峻琴.葡萄籽原花青素抗大鼠脑缺血再灌注损伤的研究［J］. 中国药师，2005,8(7):541.
       
       ［3］Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al. Reversible middle cerebral artery occusion without cranietomy in rats［J］. Stroke，1989，20(1): 84.
       
       ［4］Faubel S,Edelstein CL.Caspases as drug targets in ischemic organ injury［J］. Curr Drug Targets Immune Endocr Metabol Disord，2005，5(3):269.
       
       ［5］Wellington CL，Hayden MR.Caspases and neurodegeneration:On the cutting edge of new therapeutic approaches［J］. Clin Genet，2000，57(1):1.
       
       ［6］李浩，刘开祥，俸军林，等.丹参酮ⅡA对鼠脑缺血再灌注损伤Bcl-2和Caspase -3表达的影响［J］. 中国康复医学杂志，2008，23(8):691.
       
       ［7］贾玉洁，闵连秋，季占胜，等.原花青素对大鼠局灶性脑缺血的保护作用［J］. 中国脑血管病杂志，2005，2(12):558.
       
       ［8］陈荣志，陆景红，任明山，等.葡萄籽原花青素对大鼠脑缺血再灌注后NF -κB、κI B和iNOS的影响［J］. 华西药学杂志，2007，22 (3) :266.