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       【摘要】 
       目的采用正交实验考察丹参骨宝的酸提取液制备工艺的最佳条件。方法以丹参素钠与丹酚酸B含量之比作为评价指标，对溶剂（A）、溶剂量（B）、提取时间（C）、提取次数（D）等4个因素的3个水平进行L9(34)正交实验。结果直观分析和方差分析显示酸提取工艺因素的影响大小依次是：溶剂>溶剂量>提取时间>提取次数，最佳提取工艺条件为A3B2C1D3，即5 g丹参粗粉加4%盐酸50 ml回流提取0.5 h，共提取3次。结论通过正交实验筛选出了丹参骨宝最佳的酸提条件。
       【关键词】  丹参骨宝　正交设计　 高效液相色谱法
       Study on Optimization of Experimental Conditions for Acid Extraction of Danshen Gubao by Orthogonal DesignDuplicate Test
       LIU Liming,LV Yingnian,CUI Liao，WU Tie
       1.Department of Pharmacology of Guangdong Medical College，Zhanjiang,Guangdong 524023,China;2.Guangdong Key Laboratory for R＆D of Natural Drugs,Zhanjiang Guangdong  524023，China
       Abstract：ObjectiveTo obtain the optimization condition for preparation of Danshen Gubao acid extraction solution using orthogonal design.MethodsUsing the ratio of  contents of DanshensuNa and Salvianolic Acid B as an evaluation standard,the L9(34) experiment was carried out in consideration of 3 levels of 4 factors including solvent(A),dosage of solvent(B),extraction time(C,h),number of extraction times(D).ResultsThe optimized extraction conditions calculated by the intuitive analysis and ANOVA was A3B1C1D3,5 g SM power was added in 50 ml 4% hydrochloric acid water solution，backstreaming and boiling for 0.5 h. The gruffs was extracted three times according to above procedure.ConclusionThe optimization conditions for acid extraction of Danshen Gubao was sieved by orthogonal test.
       Key words： Danshen Gubao;   Orthogonal design;  HPLC
       
       丹参(Radix Salviae Mihiorrhiza,SM)为唇形科植物丹参（Salvia miltiorrhiza Bunge）的干燥根及根茎，具有祛淤止痛，活血通经，清心除烦的功效［1］。丹参的主要成分按照极性可分为脂溶性的丹参酮类化合物和水溶性的酚酸类化合物。丹参水溶性有效成分一般采用传统的水煎煮法提取，提取液中一般含有较多的丹酚酸B（约为生药量的2.7%），而丹参素的含量则较少（约为生药量的0.4%），此外还含有原儿茶醛等有效成分［2］。
        近年来，我们课题组发现丹参水溶性有效成分尤其是丹参素和丹酚酸B及原儿茶醛可促进成骨细胞活性从而有效预防糖皮质激素引起的大鼠骨质疏松［3，4］。进一步的体外研究发现，与传统的水提法制备的丹参提取液相比，通过酸提法制备的丹参骨宝提取液对成骨细胞的活性显著增强［5］。
        目前丹参水溶性成分的提取方法主要有水煎回流法、超声提取法等，通过这些提取方法制备的提取液中丹酚酸B的含量均比丹参素的含量高。通过解析丹酚酸B和丹参素的化学结构发现，丹酚酸B为三分子丹参素与一分子咖啡酸的缩合物［6］。前期实验发现，长时间加热或者酸性环境均会使丹酚酸B水解，导致丹酚酸B含量降低而丹参素含量增加。从节省时间考虑，本实验采用酸回流提取法制备丹参骨宝提取液。
        为了保证丹参骨宝提取液中丹参素与丹酚酸B的含量相当以及提取工艺的稳定性，本实验采用有重复的L9(34)正交实验设计，以丹参素与丹酚酸B含量之比为评价指标，考察溶剂、溶剂加入量、提取时间、提取次数对评价指标的影响，确定了丹参骨宝提取液的合理可行的酸提取制备工艺。
       1  材料与仪器
       1.1  药品与试剂 丹参素钠（批号110855200507）、丹酚酸B对照品（批号111562200403），由中国药品生物制品检定所提供，供含量测定用；丹参饮片（产地河北，湛江市恒生药业有限公司）；甲醇为色谱纯（天津四友试剂公司）；水为实验室自制三蒸水；其余试剂均为分析纯。
       2  方法与结果
       2.1  色谱条件色谱柱为Thermo Hypersil C18(5 μm，4.6 mm×250 mm);流动相为以甲醇（A相）1%冰醋酸水溶液（V/V，B相）为流动相进行线性梯度洗脱:0～9 min:10%A，9～27 min:10%A～64%A,27～30 min:64% A～10%A，流速为1 ml·min-1，检测波长为280 nm；柱温30℃。
       2.2  对照品溶液的制备精密称取丹参素钠对照品0.001 5 g，丹酚酸B对照品0.002 5 g，溶于2 ml 20%甲醇水溶液中，超声助溶5 min，即得储备液，其中丹参素钠及丹酚酸B浓度分别为0.75 mg·ml-1，1.25 mg·ml-1。
       2.3  供试品溶液的制备丹参饮片放烘箱于60℃干燥12 h后粉碎成40目粗粉。称取5 g丹参粉，加入适量的溶剂，置于电热恒温加热套上回流加热，提取结束后过滤，滤液用蒸馏水适当稀释，0.45 μm滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
       2.4  线性关系的考察将储备液用20%甲醇水溶液逐次等倍稀释，配制成一系列含有丹参素钠和丹酚酸B的标准溶液。精密吸取上述标准溶液各20 μl，注入高效液相色谱仪。以标准溶液中对照品浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，丹参素钠的回归方程为：Y=13.018X-22.913（r=1），表明丹参素钠在8.4～750 μg·ml-1之间有良好的线性关系。丹酚酸B的回归方程为：Y=18.028X-61.656（r=0.999 9），说明丹酚酸B在9.8～1.25 μg·ml-1之间有良好的线性关系。
       2.5  精密度试验精密吸取同一对照品溶液20 μl,连续进样6次，以峰面积计算精密度，丹参素钠和丹酚酸B的RSD分别为1.8%，2.1%。
       2.6  重复性实验将正交实验2号平行6份,制成供试品溶液,测定峰面积并计算浓度，丹参素钠和丹酚酸B的RSD分别为2.0%，0.58%。
       2.7  稳定性实验取正交实验2号样品，分别于0，2，4，8，10 h测定丹参素钠及丹酚酸B峰面积并计算浓度。丹参素钠和丹酚酸B的RSD分别为3.14%，0.93%。结果表明样品在10 h内稳定。
       2.8  加样回收率实验取已知含量的供试品溶液，分别添加丹参素钠及丹酚酸B对照品溶液，同法制备成供试品溶液并按上述色谱条件测定其丹参素钠及丹酚酸B浓度，计算加样回收率为分别为97.1%，98.1%。结果表明，本法具有良好的回收率。
       2.9  正交实验设计与结果采用正交实验法，选取溶剂（A）、溶剂加入量（B）、提取时间（C）、提取次数（D）等4个因素进行考察，各因素为3水平。实验因素与水平见表1，正交实验结果及方差分析见表2～3。表1  丹参酸提取实验影响因素与水平（略）表2  L9(34)正交试验结果（略）表3  方差分析（略）
        表2及表3显示，以丹参素钠与丹酚酸B含量之比为考察指标，4个因素的影响大小依次为A>B>C>D；方差分析表明只有溶剂因素对该指标的影响有显著性意义。从专业上看最佳条件为A3B2C1D3，即5 g丹参粉，加入到4%盐酸50 ml中，回流加热煮沸30 min，提取3次。2.10  重复验证实验准确称取10 g丹参粉，按照A3B2C1D3最佳条件重复实验3次。结果见表4。实验结果表明本次实验得到的最佳组合条件与试验结果一致，可实际应用。表4  重复验证实验结果（略）
       3  讨论
          
       采用传统的水煎煮法或回流提取法制备的丹参水提液中，丹参素的含量较低，丹酚酸B的含量则较高，因此不能制备出二者含量相当的提取液。本研究创新之处在于采用酸回流提取的方法，分解一定量的丹酚酸B，使丹参素的含量较水提取增加3倍左右，最终与丹酚酸B含量相当，从而达到防治骨质疏松的最佳药效。
       【参考文献】
         　　［1］国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］. 北京:化学工业出版社，2005: 52.
       
       ［2］刘敏彦，赵韶华，盖潇桦，等. 丹参不同提取方法中水溶性成分含量的比较研究［J］. 时珍国医国药,2007,18(5):1186.
       
       ［3］崔燎， 邹丽宜，刘钰瑜，等.丹参水提物和丹参素促进成骨细胞活性和防治泼尼松所致大鼠骨质疏松［J］. 中国药理学通报，2004，20(3):286.
       
       ［4］邹丽宜，吴铁，崔燎. 丹参抑制泼尼松大鼠骨质丢失［J］. 中成药，2006，28(4): 537.
       
       ［5］孙宇，崔燎，吴铁. 盐酸水提法制备丹参水溶性有效部位群及其对成骨细胞活性测定［J］. 中国药理学通报，2008，24(3):377.
       
       ［6］杜冠华, 张均田. 丹参现代研究概况与进展［J］. 医药导报，2004，23:355.