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       【摘要】 
       目的对叶下花总黄酮的种类与提取方法进行初步研究。方法采用定性检测、光谱分析、单因素测定、正交实验等，研究黄酮种类，考察乙醇体积分数、温度、固液比、时间对提取率的影响。结果叶下花含黄酮、黄酮醇、二氢黄酮、二氢黄酮醇等多种黄酮类化合物；所考察的影响因素中，对总黄酮提取率影响程度大小顺序为乙醇体积分数＞温度＞时间＞固液比。结论最佳提取条件为A1B2C3D3 (乙醇体积分数30%、温度65℃，提取时间180 min，固液比1∶80)，在此提取条件下，提取量高达5.233%。
       【关键词】  叶下花　总黄酮　提取方法　正交实验
       The Extraction Methods of Total Flavonoids in Ainsliaea pertyoides Franch
       YANG Fazhong, YANG Bin, YANG Deqiang,CHEN Houqin, DAI Hongjuan, ZHANG Li1, LI Donghai
       1.Southwest Forestry University,Kunming 650224,China;2.Yunnan Normal University,Kunming 650092，China
       Abstract：ObjectiveTo optimize the extraction conditions for the total flavonoids from Ainsliaea pertyoides Franch and to study the categories of the total flavonoids. MethodsThe methods of the chemical qualitative detection, the spectral analysis, single factor determination, orthogonal test were adopted to study the categories of the total flavonoids, and the effect of four factors, i.e. the volume fraction of ethanol, the temperature, the ratio of solid to liquid, the extracting time, on the rate of the total flavonoids, were also investigated at the same time. Results1)The total flavonoids consisted of flavones,  flavonols, flavanones, flavanonols in A. pertyoides. 2)The order of factors to affect the flavonoid extraction was volume fraction of ethanol>temperature>extracting time>ratio of solid to liquid. ConclusionThe optimum extraction conditions are A1B2C3D3. The highest extraction rate of the total flavonoids reached 5.233% under the optimal conditions.
       Key words：Ainsliaea pertyoides Franch;   Total flavonoids;   Extracting methods;   Orthogonal test
       
       叶下花Ainsliaea pertyoides Franch. var. albo-tomentosa Beauverd也称白背兔耳风、白背叶下花、追风箭等，菊科(Compositae )帚菊木族(Mutisieae Cass)兔耳风属(Ainsliaea DC)草本植物［1］，是《本草纲目》等多部药典收录的天然药用植物［1］。叶下花作为骨科良药分布广泛、资源丰富、临床应用和民间用药历史十分悠久，并能用于治疗强直性脊柱炎，填补了中药治疗在此领域的空白［2］，意义重大。本研究小组发现［3］，叶下花中黄酮类化合物具有明显的抗氧化活性和羟基自由基清除能力，但不清楚叶下花作为骨科良药的活性成分是否与此有关。已有很多文献指出，高等植物中类黄酮有多种药理作用，是一类十分重要的天然有机化合物，其中很多接骨效果很好的药用植物，其活性成分就是黄酮类化合物［4～8］，所以本工作首先对叶下花总黄酮提取方法进行研究，以期为叶下花黄酮药理活性及叶下花中药现代化的研究奠定基础。
       1  材料与仪器
       1.1  中药材叶下花干燥全草于2006-10采自云南省楚雄市树苴镇，洗净、风干、粉碎、过40目筛，备用。
       1.2  仪器与试剂   
       Unic 7200型分光光度计［尤尼柯(上海)仪器有限公司］；Bs210s电子天平(北京赛多利斯天平有限公司)；HWS12型电热恒温浴锅(上海一恒科技有限公司)；RE-2000型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；RO-DI-50-RE纯水系统(厦门锐思捷公司)。
        芦丁(rutin)标准品，成都欧康植化科技有限公司产品。FeCl3、NaNO2、Al(NO3)3、NaOH、盐酸、Mg粉、无水乙醇等均为分析纯，实验用水为去离子水。
       2  方法
       2.1  黄酮类化合物的定性检测［9］
       2.1.1  盐酸-镁粉反应取提取液1 ml加入少许镁粉，振摇后加浓盐酸4～5滴，加热3 min。
       2.1.2  三氯化铝试验取提取液滴于滤纸上，喷1% AlCl3乙醇溶液。
       2.1.3  与碱反应试验取提取液1 ml，加入10% Na2CO3 5滴。
       
       2.1.4  三氯化铁试验取提取液，滴加1%的三氯化铁溶液。
       2.1.5  铅盐沉淀试验取提取液2 ml，滴加乙酸铅试剂。
       2.1.6  Molish反应取提取液加入α-萘酚乙醇溶液，缓慢加入硫酸。
       2.2  检测波长的选择和标准工作曲线的绘制   
       采用NaNO2-Al (NO3)3-NaOH法测定总黄酮［10～12］，并稍作改动。
        精密称取芦丁标准品50 mg，置于50 ml容量瓶中，加60%乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得1 000 μg/ml芦丁标准溶液。
        同时用30%的乙醇-水(V/V)对叶下花干燥粉末进行提取，并用石油醚反复多次萃取至石油醚层无色，获得下层的叶下花总黄酮提取物，定容至合适的体积。
        将芦丁标准溶液和叶下花总黄酮提取物各取5.00 ml，先分别加入5% NaNO2溶液1 ml，摇匀，放置6 min后，分别加入浓度5% Al(NO3)3溶液1 ml，摇匀，再放置6 min后，再分别加入10%NaOH溶液10 ml，用去离子水稀释至25.00 ml，摇匀，放置10～15 min后，采用试剂参比，在分光光度计上在600～  350 nm范围内进行扫描，以获得二者的扫描图谱和最大吸收波长。
        分别准确吸取芦丁标准溶液0.00，0.10，0.40，0.70，1.00，2.00，4.00，6.00，8.00 ml，同法显色，在选定的最大吸收波长处绘制芦丁标准工作曲线。用Origin 6.1软件进行数据处理(下同)。
       2.3  单因素实验考查
       2.3.1  乙醇体积分数对叶下花总黄酮得率的影响   
       准确称取1.000 g叶下花干燥粉末，按固液比1∶50(g/ml)加入20%，25%，30%，40%，50%，60%，70%的乙醇-水(V/V)溶剂，在温度为70℃下浸提1.5 h，滤过，定容至100 ml，取5 ml按本实验“2.2”进行测定，计算不同乙醇体积分数时叶下花总黄酮百分含量，用于考查对得率的影响。
       2.3.2  最佳提取温度的选择
       采用30%的乙醇溶液，在温度为50，60，70，80，90℃时，其他条件与“2.3.1”项下的相同，测定不同温度下的黄酮含量，以确定最佳提取温度。
       2.3.3  最佳固液比的选择
       按固液比分别为1∶30，1∶40，1∶50，1∶60，1∶70加入30%的乙醇溶液，其他条件与“2.3.1”的相同，测定不同固液比条件下的黄酮含量，以确定最佳固液比。
       2.3.4  最佳提取时间
       考察按乙醇体积分数为30%、固液比为1∶60、提取温度为70℃的条件进行提取，但提取时间分别为60，120，150，180 min，测定不同时间下的总黄酮得率，以考查提取时间的影响。
       2.4  正交实验优化提取条件   
       因溶剂体积分数、提取温度、固液比、提取时间对叶下花总黄酮得率均有影响，故在单因素实验基础上，利用正交实验进一步对各影响因素之间的交互关系进行研究，以确定最佳提取条件。正交表头设计L9(34)见表1。表1  实验因素水平L9(略)
       3  结果
       3.1  黄酮类化合物定性检测结果利用黄酮类化合物在不同试验中产生的特殊颜色反应，可以对黄酮类化合物进行定性分析，结果见表2。
        从表2可以看出，叶下花植物中含有黄酮、黄酮醇、二氢黄酮、二氢黄酮醇、7, 4′ - 二羟基黄酮醇等多种类型的类黄酮化合物，种类十分丰富。已有资料表明［6］，不同种类、不同结构的黄酮，其药理活性、抗氧化活性等多种生物活性有着明显不同，叶下花黄酮可能同时具有接骨、抗炎、抗菌多方面的药理活性，与临床应用研究结论一致［4］，具有明显的研究价值。表2  黄酮类化合物的定性检测（略）
       3.2  吸收光谱和标准工作曲线绘制对芦丁和叶下花总黄酮提取物进行扫描所得的吸收光谱如图1。
        由图1可知，叶下花总黄酮和芦丁的光吸收曲线较为相似。二者均在510 nm处有最大吸收，波形也十分相似。此最大吸收峰是由黄酮化合物中B环桂皮酰基(cinnamoyl)系统引起的带I吸收(300～400 nm)红移的结果［在强碱性条件下用Al(NO3)3显色］。同时芦丁在385 nm处也有一个明显的吸收峰，而在相同位置叶下花总黄酮仅表现为一个肩峰，并在385 nm以下有强吸收。带Ⅰ吸收较弱，带Ⅱ吸收较强，可知主要含有黄酮和黄酮醇类。从波谱扫描图谱中不但可以确认叶下花提取物中含有黄酮类化合物，且种类较多，与“3.1”项中预实验结果相似。
        本实验选定510 nm作为测定波长，获得标准曲线回归方程为A = 0.009 841C + 0.046 92，A为吸光度，C为浓度(μg/ml)，线性相关系数r = 0.999 77，线性范围4.00～ 200.00 μg/ml。线性关系良好，线性范围很宽，可作为叶下花总黄酮得率的测定方法。
       3.3  单因素测定结果
       3.3.1  乙醇体积分数对叶下花总黄酮得率的影响
       结果如图2。随乙醇体积分数增加，叶下花总黄酮得率逐渐增加，当乙醇体积分数增加至30%时，得率达最高，但继续增加乙醇体积分数，得率反而下降，所以确定提取黄酮所需乙醇的最佳体积分数为30%。
       3.3.2  温度对总黄酮得率的影响   
       结果如图3。在65℃左右得率达到最大值，温度过高则黄酮含量反而有所降低，可能与高温下部分黄酮发生分解有关，所以确定65℃为叶下花黄酮的最佳提取温度。
       3.3.3  固液比对总黄酮得率的影响   
       结果如图4。当固液比为1∶60时，总黄酮得率最高，再增加溶剂用量，变化不大。
       3.3.4  时间对总黄酮得率的影响
       结果如图5。可以看出，120min左右可将叶下花中的大部分黄酮提取出来。
       3.4  正交实验结果与分析如表3所示。从表中K1，K2，K3，R分析得到，乙醇体积分数、温度、固液比、提取时间4因素对黄酮提取量影响的主次顺序及最佳提取条件为：A1B2C3D3，即乙醇体积分数30%，温度65℃，提取时间180min，固液比1∶80。
       3.5  正交实验结果验证由于从正交实验中得出的最佳提取条件在所做的实验中并未出现，需要进行验证。按最佳提取条件并采用与“2.3.1”项相似的方法进行提取，重复4次，结果叶下花总黄酮提取量为5.233%(RSD为1.4%)，在本实验中提取量达到最大。同时可见，叶下花总黄酮含量很高，具有明显研究价值。表3  正交实验结果（０
       4  结论
        利用现代中医药理论研究中草药叶下花的报道还十分少见，与十分普遍的用药状况相比形成极大的反差。本文通过定性检测、光谱分析、单因素测定、正交实验等研究，确认了黄酮最佳提取条件为乙醇体积分数30%，温度65℃，提取时间180 min，固液比1∶80，在此提取条件下，提取量高达5.233%。叶下花中黄酮种类较多、含量极为丰富，具有明显的研究价值和开发利用前景。研究结果为中草药叶下花黄酮类化合物的进一步开发利用奠定了坚实基础，并为叶下花中药现代化提供理论依据。
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