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       【摘要】 
       目的对细菌纤维素高产菌株葡糖醋杆菌G-29进行发酵优化，以提高其细菌纤维素合成能力。方法采用基于非完全平衡块原理的Plackett-Burman(PB) 试验设计法，筛选出了3个主要影响因子：混合碳源（葡萄糖∶蔗糖=1∶2），MgSO4，乙醇，然后采用Box-Behnten中心，组合试验设计和响应面分析方法（RSM）确定其最佳浓度分别为混合碳原52.3g/L，MgSO40.159 8 g/L，乙醇32.5 ml/L。用扫描电镜观察了细菌纤维素的形态结构，并通过X射线衍射分析其在干态下和湿态下的最佳结构。结果在优化培养基条件下，菌株G-29发酵生产细菌纤维素的产量为11.83 g/L，是优化前产量（6.20 g/L）的1.9倍。结论PB试验和RSM相结合的试验方法，用于优化G-29发酵培养基，不仅科学合理而且准确有效。
       【关键词】  葡糖醋杆菌属 细菌纤维素 Plackett-Burman设计 响应面分析
       Optimization of Bacterial Cellulose Fermentation Conditions by Response Surface Methodology
       YUAN Shuai，HU Cheng，CAO Haipeng， TANG Defang，SUN Miaomiao
       College of Life Sciences, Key Laboratory of Bio-resources and Eco-environment of Ministry of Education, Sichuan University, Chengdu 610064, China
       Abstract：ObjectiveIn this manuscript,the optimal conditions for cellulose production by gluconacetoba-ater G-29 were determined in order to improve the yield of bacterial cellulose.MethodsPlackett-Burman Design was used to evaluate three statistically significant parameters including mixed carbon sources(Glucose:sucrose=1:2),MgSO4,ethanol.The optimal levels of three variables were defined by Box-Behnken design and response surface method(RSM):mixed carbon sources:52.3 g/L,MgSO4 0.159 g/L,ethanol 32.5 g/L,ethanol 32.5 g/L comparison.The morphology of bacterial cellulose(BC) produced was observed by scanning electron microscope(SEM).The crystal structure of BC in dried and wet state was studied by X-ray diffractometry(XRD).ResultsThe results indicated that the BC yield under the optimal fermentation medium was 11.83 g/L,which was as 1.9 times as that under the original fermentation medium.ConclusionThe method of PB design combined with RSM used for optimization of G-29 fermentation medium is scientific and accurate.
       Key words： Gluconacetobacter;   Bacterial cellulose;   Plackett-Burman design;   Response surface method
       
       细菌纤维素(Bacterial cellulose，简称 BC)是由部分细菌产生的一类高分子化合物，在化学组成和结构上同植物纤维相同，都是由D-葡萄糖以β-1,4糖苷键连接形成直链多糖，再经聚合而成。与植物纤维不同的是细菌纤维素是以单一纤维形式存在，纯度极高，不掺杂如植物纤维中的半纤维素或木质素等其它多糖类［1］，因此其具有抗拉强度高、 杨氏模量高、良好的生物适应性以及优良的持水性和通透性等特点［2］。除了可用作膳食纤维和食品成型剂，还可用于生产纱布、绷带、人造皮肤等生物医学用品，有利于皮肤组织生长和限制感染。
       
       自1987年以来，已有很多关于细菌纤维素膜用于烧伤、烫伤、皮肤移植等治疗的报道，目前已发展出纱布、绷带和“创可贴”等各种伤科敷料商品。它具有在伤口中维持湿的环境，防止体液流出，保持高机械强度，对液、气具有良好通透性，与皮肤相容性好、无毒、不发热，良好的防菌和隔离性等众多特点，均优于当今其它人造皮肤和伤科敷料。早在20世纪80年代初，巴西的Biofill公司就开始了用细菌纤维素膜制造伤科敷料的研究，成功开发出人造动脉，人造血管与人造皮肤等医疗用品［3］，并已成功地应用于处理皮肤移植和慢性皮肤溃疡。这种材料可有效缓解疼痛，防止细菌感染，有利于皮肤组织生长，促进伤口愈合，对水分及电解物有良好的通透性，与传统的材料相比，这种材料成本低，处理时间短，更有利于健康皮肤的生长［4］。除此之外，细菌纤维素还可作为缓释药物的载体，软骨组织工程的支架材料［5］等。
       
       能产生细菌纤维素的细菌种类较多，常见的有醋酸菌属、土壤杆菌属、假单胞杆菌属、无色杆菌属、产碱杆菌属、气杆菌属、固氮菌属、根瘤菌属和八叠球菌属等9个属中的某些种。其中醋酸菌属中的木醋杆菌（Acetobacter xylinum）是最早被发现同时也是研究较为透彻的纤维素产生菌，现已作为研究纤维素生物合成过程和机制的模式菌株。根据《伯杰氏系统细菌学手册》第9版，木醋杆菌已被划分到葡糖醋杆菌属（Gluconacetobacter）中，改为木葡糖醋杆菌（Gluconacetobacter xylinum）。
       
       近几年关于细菌纤维素生产合成的研究仍多以木葡糖醋杆菌或其变种做为试验菌种，为此，本实验室分离筛选出一株细菌纤维素高产菌G-29，并经16S rDNA测序鉴定该菌为葡糖醋杆菌属中一个新的菌种。
        本实验以G-29为试验菌种，在前期试验的基础上，利用响应面分析法［6］，对其发酵培养基的诸多营养因素进行考察和评价，并确定了细菌纤维素合成的重要影响因子的最优水平，取得了较好的发酵效果，为进一步提高其产量和后续的放大培养奠定基础。
       1  材料
       1.1  菌种来源葡糖醋杆菌（Gluconacetobacter sp.）G-29，由本实验室课题组2008年从成都市所采集的水果样品中分离获得，保存于四川大学生物资源与生态环境教育部重点实验室。
       1.2  培养基斜面培养基：葡萄糖30 g/L，酵母膏5 g/L，Na2HPO4 1 g/L，MgSO4 0.15 g/L，乙醇20 ml/L，琼脂18 g/L，pH6.0；种子培养基：葡萄糖50 g/L，酵母膏15 g/L，Na2HPO4 3 g/L，MgSO4 0.2 g/L，乙醇40 ml/L，pH 6.0；用于响应面分析的基础发酵培养基：葡萄糖30 g/L，酵母膏5 g/L，Na2HPO4 1 g/L，MgSO4 0.15 g/L，乙醇20 ml/L，pH 6.5；优化后的发酵培养基：混合碳源52.3 g/L（葡萄糖:蔗糖＝1:2），酵母膏8 g/L，FeSO4 0.2 g/L，MgSO4 0.159 g/L，Na2HPO4 2 g/L，柠檬酸1 g/L，乙醇32.5 ml/L，pH 6.5。
       1.3  培养条件挑取一环活化的斜面菌种至装有100 ml种子培养基的250 ml三角瓶中，30℃，110 r/min振荡培养24 h，然后按照8％的接种量，将种子培养基接入装有100 ml发酵培养基的250 ml三角瓶中，8层纱布封口，30℃静置培养7 d。
       2  方法
       2.1  细菌纤维素的产量测定从培养基中取出纤维素膜，用水多次冲洗，除去膜表面培养基及杂质。再将膜浸泡于0.1 mol/L的NaOH溶液，100℃煮沸20 min，去除液膜中的菌体和残留培养基，膜呈乳白色半透明。然后用蒸馏水多次冲洗，用pH试纸轻压膜测pH值，约7.2，80℃干燥至恒重。纤维素含量用g/L表示。
       2.2  发酵培养基优化方法Plackett-Burman设计、Box-Behnken中心试验设计及响应面分析。
       3  结果
       3.1  Plackett-Burman设计法筛选重要因素 根据笔者前期实验，本研究选取混合碳源（葡萄糖∶蔗糖=1∶2），酵母膏，FeSO4，Na2HPO4，MgSO4，柠檬酸、乙醇作为PB试验的7个因素，每个因素取两个水平，因素水平及编码见表1，数据分析及模型建立由Design Expert软件完成。表1  Plackett-Burman(PB)实验设计因素水平及编码（略）
           
       根据Plackett-Burman实验设计得到的7因素12实验组合，依次进行培养基的配制、接种、发酵试验(每组3个平行，取平均值)，以细菌纤维素干重为响应值Y。结果如表2所示。
       
       由表3可以看出，对G-29发酵合成能力影响最大的因素是混合碳源（葡萄糖/蔗糖=1∶2），其次是乙醇和MgSO4。这3个因素对细菌纤维素产量影响显著，置信度高于90%，可作为进一步优化的因素。而其它4个因素对发酵产量的影响未达到显著水平，在下一步的研究中不予考虑。表2   Plackett-Burman(PB)试验结果（略）表3  Plackett-Burman试验主效应分析（略）
       3.2  重要因素与产量关系的2次方程的建立由Box-Behnken和Box-Wilson提出的中心组合设计是两种常用的响应面分析法，适用于2～5个因素的优化试验。Box-Behnken每个因素取3种水平，以(-1，0，+1)编码，对数据进行二次回归拟合，得到带交互相和平方相的二次方程，分析各因素的主效应和交互效应，最后在一定的水平范围内求出最佳值。对发酵产量有显著性影响的3个因素的水平及编码见表4。 表4Box-Behnken试验因素水平及编码  （略）
       在Plackett-Burman试验的基础上，在最陡爬坡试验确定的浓度区域内，对影响G-29合成细菌纤维素的关键因素按照Box-Behnken设计进行l5组试验(每组3个平行，取平均值)，以细菌纤维素干重为响应值Y。结果见表5。表5  Box-Behnken设计与细菌纤维素产量（略）
        利用统计软件Minitab15对表5数据进行二次多项式拟合，获得细菌纤维素产量(Y)对自变量葡萄糖/蔗糖(x1)，MgSO4 (x2)，乙醇(x3)的多元回归方程：Y=11.223 3+0.443 8X1+0.208 8X2+0.415 0X3-0.927 9X12
       -0.587 9X22-0.825 4X32-0.002 5X1X2-0.050 0X1X3+0.000 0X2X3
       
       从该方程的方差分析(表6)可知，该模型极显著(P<0.001)。确定系数R2=0.994 9，离回归标准差S=0.098 6，说明回归方程与实际拟合良好，可以用于细菌纤维素发酵的分析和预测。从回归方程系数显著性检验(表7)可知，在模型参数中，X1，X2，X3，X12，X22，X32对细菌纤维素产量的影响都极显著，而X1，X2，X3 这3个主效应因子之间的交互作用对细菌纤维素产量的影响不显著。表6  发酵培养基多元二次方程方差分析表（略）
       3.3  响应面分析及最佳培养条件确定通过回归方程来绘制分析图，考察所拟合的相应曲面的形状，响应面立体分析图和相应等高线图见图1～3。通过该组图可对主效应因子对细菌纤维素产量的两两交互作用进行评价，并确定各个因素的最佳水平范围。表7  发酵培养基多元二次方程方差分析表（略）
       由图1～3可知，该回归方程存在稳定点，即极大值点，经分析可知回归模型的稳定点的编码值为：X1=5.232 3，X2=0.015 9，X3=3.252 5，相当于葡萄糖/蔗糖为5.232 3 g/100 ml，MgSO4 0.015 9 g/100 ml，乙醇3.252 5 ml/100 ml，在此最优条件下，细菌纤维素的预测最大产量为11.347 g/L。为验证模型的准确性和有效性，用预测的最优发酵培养基进行发酵实验，可得实际细菌纤维素产量为11.83 g/L，是优化前的基础发酵培养基产量(6.20 g/L)的1.9倍。由此，进一步证明该回归方程能够真实的反映筛选因素对细菌纤维素产量的影响，可用于预见实际发酵情况，对发酵条件的研究具有指导意义。
       ３.4  细菌纤维素形态与晶体结构分析
        细菌纤维素膜经水冲洗和稀碱液处理后，残留的发酵液及菌体被除去后，细菌纤维素膜呈乳白色半透明胶状（图4），外表均匀光滑，质地柔韧。经干燥后，由电镜扫描可观察其微观结构为典型的超微细网状结构(图5)，由高密度微纤维进行无规则的层状重叠，互相缠绕形成。
       纤维素X-射线衍射图谱是以衍射角为横坐标，衍射强度为纵坐标，以晶胞(101)，(101)和(002)面的衍射峰为计算基准。由图6可以看出，干膜的衍射图分别在14.94  2θ和22.45  2θ处有两个主要的衍射峰，这是纤维素I的特征峰，即细菌纤维素的晶体结构属于纤维素I。其中2θ为22.45处的衍射峰对应晶面(002)，在纤维素X-射线衍射图谱中，2θ值在22.50附近的峰高代表了002面的衍射强度，即结晶区的强度。由衍射图谱可看出，G-29合成的细菌纤维素，结晶指数高，结晶强度大。而图7则反映了湿膜的衍射峰，只在28.5 2θ和42 2θ处有衍射峰，没有呈现出纤维素I的衍射峰，表明湿态的晶面面间距比干态的小。这两个峰的峰宽比干态下大，表明其结晶不完全，结晶度低，晶粒尺寸小。可能是由于细菌纤维素湿膜含有大量的水，导致纤维素分子链之间的距离增大，在水分子与纤维素链的相互作用下，纤维素分子链之间的氢键模式发生改变，从而影响了细菌纤维素膜的晶型和晶粒尺寸，导致其的结晶度变低。
       4  结论
        本实验采用了Plackett-Burman试验设计，对影响菌株G-29合成细菌纤维素的7个因素进行了评价，筛选出了混合碳源（葡萄糖∶蔗糖=1∶2），乙醇和MgSO4为影响细菌纤维素产量的关键因子。葡萄糖是合成细菌纤维素的原料，蔗糖可以缓解发酵过程中pH值的急剧降低；乙醇可以被细菌氧化为乙酸，同时生成用于细胞合成的ATP等高能量化合物［7］，对细菌纤维素的合成起促进作用，而MgSO4中的Mg2+是纤维素合成酶的激活剂。因此，以PB试验筛选出的主要影响因子能够反映实际情况，证明该方法是一种经济而有效的试验方法。
       
       通过响应面法(RSM)建立了细菌纤维素发酵培养基的回归模型：Y=11.223 3+0.443 8X1+0.208 8X2+0.415 0X3-
       0.927 9X12-0.587 9X22-0.825 4X32-0.002 5X1X2-
       0.050 0X1X3+0.000 0X2X3该模型高度显著，可用于实际分析与预测。
        优化后的发酵培养基组成：混合碳源52.3 g/L（葡萄糖∶蔗糖＝1∶2），酵母膏8 g/L，FeSO4 0.2 g/L，MgSO4 0.159 g/L，Na2HPO4 2 g/L，柠檬酸1g/L，乙醇32.5 ml/L，此条件下的发酵产量是优化前的基础发酵培养基产量(6.20 g/L)的1.9倍，表明Plackett-Burman试验和响应面相结合的试验方法用于优化G-29发酵培养基，不仅科学合理而且准确有效。
        细菌纤维素具有超微结构，湿膜的固形物含量低，持水性高，结晶不完全；干燥后结构致密，抗拉强度高，结晶指数高，结晶强度大。
       【参考文献】
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