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       【摘要】 
       目的优选出新疆石榴籽中总多酚的提取方法。方法以多酚含量为指标，采用单因素实验设计与正交实验设计优选新疆石榴籽中总多酚提取工艺。结果石榴籽中总多酚最优提取工艺为：乙醇浓度为60%，提取温度100℃，回流提取1次，每次1.0h，每次加乙醇量为石榴籽粉末量的12倍。结论验证实验表明优选出的提取方法稳定，合理，可行。
       【关键词】  新疆石榴籽 总多酚 提取工艺
       石榴Punica granatum L.为石榴科Punicaceae石榴属(Punica L.)落叶灌木或小乔木［1］，全世界共有1属［石榴属（Punica L.）］，2种，产于地中海及亚洲西部地区，现在主要分布在亚热带及温带地区，在我国南北各地区均有种植。石榴籽具有降低血糖、抗腹泻的功效，并具有显著的抗人体乳腺癌和抗氧化活性，可用于预防和治疗乳腺癌及动脉硬化引起的心脏病，具有延缓人体衰老的功效［2］，这些生理、药理活性都与其所含的多酚类成分有关。
         
       植物多酚是一类广泛存在于植物体内的多酚类化合物。近年来,多酚类物质的生物活性及对人体的保健预防作用日益受到人们的关注,其清除机体内自由基、抗脂质氧化、延缓机体衰老、预防心血管系统疾病、防癌、抗辐射等生物活性功能的发现,使多酚的研究和应用越来越受到重视［3］。石榴中的多酚类成分主要是黄酮类化合物,浓缩单宁和水解单宁［4］。本文采用单因素实验和正交实验优选了新疆石榴籽中总多酚的提取工艺，为石榴的进一步综合利用提供一定的依据。
       1   仪器与材料
       1.1  仪器RE-52旋转蒸发器（上海安亭电子仪器厂）；ZK-82B型真空干燥箱（上海市实验仪器总厂）；UV-2550PC紫外-可见分光光度计(日本岛津)；SartoriusBS110S电子天平（北京塞多利）；HWS24型电热恒温水浴锅（上海一恒科技有限公司）。
       1.2  试剂乙醇、碳酸钠、钨酸钠、钼酸钠、磷酸、硫酸锂、液溴、浓盐酸、无水碳酸钠等均为分析纯试剂；没食子酸对照品(批号为110831-200302，中国药品生物制品检定所,供含量测定)；Folin-Ciocalteu试剂(自制)。
       1.3  原料榨汁后的石榴籽40℃烘干，粉碎过40目筛。
       2  方法与结果
       2.1  总多酚的测定采用Folin-Ciocalteu法测定石榴籽中总多酚含量，其反应原理为酚类化合物在碱性条件下可以将钨钼酸还原，生成蓝色的化合物，颜色的深浅与酚类化合物含量呈正相关，在波长760 nm左右有最大吸收。
       2.1.1   Folin-Ciocalteu试剂的制备 在1 000 ml的磨口圆底烧瓶中加入钨酸钠50 g，钼酸钠12.5 g,蒸馏水350 ml，浓磷酸25 ml，浓盐酸50 ml，充分混匀，小火回流10 h。再加入硫酸锂75 g，蒸馏水25 ml，溴水数滴，开口继续沸腾15 min，使溴水挥发完全为止。冷却后定容至500 ml，过滤，滤液呈绿色，置于棕色试剂瓶中保存。使用时加入1倍体积的蒸馏水，此液为应用液，置于冰箱中可以长期保存［5］。
       2.1.2  对照品溶液的制备 取没食子酸对照品2.79 mg，精密称定，置50 ml棕色容量瓶中，蒸馏水溶解定容至刻度，作为对照品溶液。
       2.1.3  标准曲线的绘制精确吸取上述没食子酸对照品溶液0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0,3.5 ml于25 ml棕色容量瓶中，加适量蒸馏水，依次加入Folin-Ciocalteu试剂1 ml和75 g/L碳酸钠溶液8ml，蒸馏水定容至刻度，充分混匀后在室温下静置1 h，于波长760 nm处分别测定吸光度值，以吸光度值（A）对没食子酸含量（C）进行线性回归，得回归方程为A=0.103 4C+0.030 7，r=0.999 9，没食子酸浓度在1.11～7.81 μg/ml范围内线性关系良好。
       2.1.4  供试品溶液的制备称取20 g石榴籽粉末，置于1 000 ml圆底烧瓶中，照各试验项下条件，回流提取，过滤，真空浓缩，得石榴籽总多酚提取物，蒸馏水定容至100 ml，精密吸取1 ml置25 ml容量瓶中，蒸馏水稀释至刻度，作为供试品溶液。
       2.1.5  样品测定方法精密吸取2 ml供试品溶液于25 ml棕色容量瓶中，依次加入Folin-Cio-calteu试剂1 ml，75 g/L碳酸钠溶液8 ml，蒸馏水定容至刻度，充分混匀后在室温下静置1 h，于波长760 nm处测定吸光度值，计算其浓度值。
       2.2  提取方法的筛选
       2.2.1   单因素实验
        不同乙醇浓度对多酚提取率的影响：将提取次数固定为1次，溶媒量固定为8倍，提取时间固定为1h，提取温度固定为30℃，分别以20%，40%，60%，80%，100%的乙醇溶液为提取溶媒，考察不同浓度的乙醇对石榴籽中总多酚提取率的影响。结果见表1。表1  不同乙醇浓度对石榴籽中多酚提取率的影响（略）
       不同提取时间对多酚提取率的影响：将提取次数固定为1次，溶媒量固定为8倍，乙醇浓度固定为60%，提取温度固定为30℃，分别以0.5，1.0，2.0，3.0，4.0 h为提取时间，考察不同提取时间对石榴籽中总多酚提取率的影响。结果见表2。表2  不同提取时间对石榴籽中多酚提取率的影响（略）
        不同提取温度对多酚提取率的影响：将提取次数固定为1次，溶媒量固定为8倍，提取时间固定为1 h，乙醇浓度固定为60%，分别以30，40，60，80，100℃为提取温度，考察不同提取温度对石榴籽中总多酚提取率的影响。结果见表3。表3  不同提取温度对石榴籽中多酚提取率的影响（略）
        不同溶媒量对多酚提取率的影响：将提取次数固定为1次，提取时间固定为1h，乙醇浓度固定为60%，提取温度固定为30℃，分别以8倍，16倍，24倍，32倍，40倍为溶媒量，考察不同溶媒量对石榴籽中总多酚提取率的影响。结果见表4。表4  不同溶媒量对石榴籽中多酚提取率的影响（略）
        不同提取次数对多酚提取率的影响：将溶媒量固定为8倍，提取时间固定为1h，乙醇浓度固定为60%，提取温度固定为80℃，分别提取1次，2次，3次，考察不同提取次数对石榴籽中总多酚提取率的影响。结果见表5。表5  不同提取次数对石榴籽中多酚提取率的影响（略）
       2.2.2  正交实验实验设计：单因素实验表明，提取次数与提取时间对石榴籽中多酚得率无显著影响，而提取温度，溶媒量和提取溶剂对多酚提取率影响较大，综合考虑多酚理化性质及生产实际，确定提取次数为1次，回流提取1.0 h，并采用正交实验筛选最佳提取工艺，实验因素水平见表6，以多酚提取率为考察指标，采用正交表安排实验，制定实验方案。结果见表7。表6   因素水平（略）
       表7   L9（34）正交实验（略）
        数据处理：以多酚提取率为考察指标进行直观分析和方差分析，结果见表7，表8，对直观分析和方差分析进行综合考虑，确定最佳提取条件为：乙醇浓度60%，提取温度100℃，溶媒加入量为12倍。乙醇浓度和提取温度两因素对多酚提取得率有显著影响，其影响的顺序为提取温度>乙醇浓度>溶媒量。
        验证实验：称取100 g石榴籽粉末3批，按最佳提取工艺条件提取，进行验证实验，结果见表9。表8  方差分析（略）表9  验证实验（略）
        将上述提取物中多酚提取率进行方差分析及q检验，结果表明3批提取物中多酚提取率均无显著性差异（P>0.05）。
        
       3 讨论
        植物总多酚常用的含量测定方法有Folin-Cio-calteu法，酒石酸亚铁法，普鲁士蓝法和高锰酸钾法等。其中,Folin-Ciocalteu法具有操作简单，效率高，设备要求低，显色明显，精密度高，稳定性和重现性好，回收率高等优点。本试验采用该方法测定总多酚时，溶液体系均一，工作曲线线性良好，故选用Folin-Ciocalteu法。
       
       本文首先采用单因素实验对可能影响提取结果的5个因素进行单因素考察，结果表明每个因素对提取结果均有不同程度的影响，再结合工业生产实际及石榴籽中多酚的理化性质，采用正交实验考察乙醇浓度、提取温度和溶媒量对石榴籽中多酚提取率的影响，并优选出了提取工艺，结合直观分析与方差分析，确定最佳提取工艺条件为：乙醇浓度为60%，提取温度100℃，回流提取1次，1.0 h/次，每次加乙醇量为石榴籽粉末量的12倍。乙醇浓度和提取温度两因素对多酚提取得率有显著影响，其影响的顺序为提取温度>乙醇浓度>溶媒量。
       【参考文献】
         　　［1］李海霞,王 钊,刘延泽.石榴科植物化学成分及药理活性研究进展［J］.中草药,2002,33(8):765.
       
       ［2］杜欣,叶盛英.石榴叶和石榴皮药理活性研究进展［J］.天津药学,2007, 19(2):55.
       
       ［3］周跃勇,王岸娜,吴立根.从猕猴桃中提取多酚的研究［J］.食品研究与开发,2007,28(03):56.
       
       ［4］Navindra P.seeram,Risa N.Schulman,David Heber.Pomegranate:Ancient Roots to Modern Medicine［M］.CRCPRESS,2006:1.
       
       ［5］曹炜,索志荣.Folin-Ciocalteu比色法测定蜂蜜中总酚酸的含量［J］.食品与发酵工业,2003,29(12):80.