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       【摘要】 
       目的研究鹰嘴豆中胰蛋白酶抑制剂的最佳提取条件。方法以提取液对胰蛋白酶的抑制率为指标，采用正交实验法对提取温度(A)、溶剂用量(B)、pH值(C)、提取时间(D)4个因素进行优选，并对优选的提取方案进行验证。结果在所选水平范围内，因素C和B对提取效果有显著的影响，因素D和A影响不显著。结论该文属国内首次关于鹰嘴豆胰蛋白酶抑制剂成分的研究报告，其有效部位的最佳提取工艺为C1B3D1A3。
       【关键词】  鹰嘴豆　胰蛋白酶抑制剂　正交实验
       Study on the Extraction Procedure of Trypsin Inhibitor of Chickpea Seeds
       FU Xuanhe, LIU Tongxiang, ZHANG Zongshen, WANG Jifeng
       1.School of Biology and Food Engineering, Dalian Polytechnic University, Dalian, 116034, China; 2.Institute of Chinese Minority Traditional Medicine, Central University For Nationalities, Beijing 100081, China; 3.School of Basic Medical Sciences, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China
       Abstract：ObjectiveTo optimize the extraction procedure of trypsin inhibitor from Cicer arietinum L.．MethodsThe inhibition rate of trypsin activity was used as screening parameter, and then optimize the four factors including temperature of extraction solution (A), volume of extraction solution (B), pH value of extraction solution(C) and time of extraction (D), thereafter, practise the optimal procedure. ResultsFactors C and B displayed the most significant effect on the extraction, and Factors D and A came the next.ConclusionFor the first time, we documented the identification of TI and its extraction procedure from Cicer arietinum L., and the optimal extraction procedure was C1B3D1A3 when the inhibition ratio of trypsin activity was considered as preferential parameter.
       Key words：Cicer arietinum L.; Trypsin inhibitor; orthogonal design
        胰蛋白酶抑制剂(Trypsin inhibitor ,TI)除了在临床上用来治疗急性胰腺炎、肺气肿、脑水肿和脑缺血外，目前还发现它在HIV和肿瘤的治疗中也有重要意义［1］。化学合成的TI生物利用度低、副作用大以及产生耐药性等缺点，植物来源的TI具有兼容性好、安全和特殊的药物特性等优点。鹰嘴豆Cicer arietinum L.产量居世界豆类第3位［2,3］，在我国新疆地区大量种植。本文发现鹰嘴豆中也含有丰富的TI，然后对其提取分离工艺进行了优化，本结果对开发新的植物TI具有重要意义。
       1  器材
       1.1  试剂和材料鹰嘴豆Cicer arietinum L.购于新疆农场，胰蛋白酶(北京麒麟宏伟公司)，大豆蛋白酶抑制剂和苯甲酰DL-精氨酸对硝基苯胺(上海三杰生物技术有限公司)，其它试剂均为国产分析纯。
       1.2  仪器可见光分光光度计、高速冰冻离心机、精密pH 计、数显恒温水浴锅、索氏提取仪等。
       2  方法
       2.1  鹰嘴豆胰蛋白酶抑制剂的抑制率测定方法参考杜旭东等［4，5］的苯甲酰DL-精氨酸对硝基苯胺(BAPNA)法。
       2.2  鹰嘴豆胰蛋白酶抑制剂的制备鹰嘴豆经手工脱皮、30 ℃下烘干、粉碎、索式提取仪脱脂后，于4 ℃冰箱中保存备用。
       2.3  各因素最佳范围的确定
       2.3.1  最适提取液体积的确定分别以20，30，40，50，60和70倍(W/V)体积于鹰嘴豆干粉中加蒸馏水，在20 ℃下提取2 h。粗提液于4 ℃下10 000 r·min-1离心15 min，上清液经减压浓缩到一定体积后，测定其对胰蛋白酶活性的抑制作用。结果如图1所示，随着提取液体积比的增大，对胰蛋白酶的抑制率也升高，到40倍体积比后抑制率不再上升，表明TI完全浸出。
       2.3.2  最适pH值的确定在20 ℃下按1∶40体积比，调节pH值分别为4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，提取2 h后，余下步骤与“2.3.1”项所述一致。结果如图2所示，在pH值为4.0和7.0时的TI抑制率最大。由于在酸性溶液浸提时浸提液澄清，能除掉较多的杂蛋白，故在后续实验中采用酸性提取。
       2.3.3  最适提取时间的确定在20 ℃下按1∶40体积比，调pH为4.0，分别浸提1.5，2.5，3.5，4.5，5.5 h后，余下步骤按“2.3.1”项所述进行。结果（见图3）表明，随着时间的延长，提取液对胰蛋白酶的抑制率上升，当达到3.5 h后达到最大值，表明已经提取完全。
       2.3.4  最适提取温度的确定按1∶40体积比，调pH为4.0，分别在20，35 ，50 ，65 ，80 ℃水浴下浸提3.5 h，余下步骤与“2.3.1”项一致。结果表明，在20 ～35 ℃时提取液对胰蛋白酶的抑制率上升，35 ℃左右时达到最大。
       2.4  各因素影响下最优提取条件的确定
       2.4.1  鹰嘴豆胰蛋白酶抑制剂提取的正交实验设计根据单因素水平确定的条件范围，称取5 g脱脂鹰嘴豆粉，在平行操作条件下，选用L9(34)正交实验表进行提取实验，以胰蛋白酶活性大小为指标，进行9次实验，每次实验重复3次(正交因素、水平见表1)。表1  因素水平（略）
       2.4.2  结果与方差分析见表2～3。从R值可知，各因素的影响C>B>D>A。由K值可以得出最佳的提取条件为C1B3D1A3，即在pH为4.0，提取溶液用量为1∶40时，50 ℃下浸提1.5 h提取工艺最好。以此工艺条件进行验证实验，其抑制率为99.46%，是所有实验中抑制率最高的。由方差分析可知各因素对提取效果的影响程度依次为C>B>A>D，其中因素C与B为高度显著，因素D和A对实验结果的影响较小不计入统计范畴。表2  L9(34)正交实验结果（略）表3  正交实验的方差分析（略）
       3  结论
        从经济效益、提取效率等因素考虑，鹰嘴豆TI 的最佳提取条件为：40倍提取体积，30～40 ℃，提取液pH值为4.0和7.0，提取时间为3.5～4 h。结果表明提取的TI属于酸性蛋白，有耐高温的特点。通过正交设计优化后的提取条件具有工艺简单、提取率高、操作控制容易、稳定性好的特点。
       【参考文献】
         　　［1］刘同祥,牛建昭,杜旭东,等. 具有蛋白酶抑制剂活性成分中药的筛选［J］.中国中药杂志, 2007, 32 (7) :643.
       
       ［2］Poltronieri F, Arêas J A G, Colli C. Extrusion and Iron Bioavailability in Chickpea (Cicer arietinum L.)［J］. Food Chemistry,2000,70:175.
       
       ［3］Clemente A, Vioque J, Sánchez-Vioque R. Effect of Processing on Water Adsorption and Softening Kinetics in Chickpea (Cicer arierinum L.) Seeds［J］.Journal of the Science of Food and Agriculture,1998,78:169.
       
       ［4］杜旭东,刘同祥,张宗申,等.正交实验法优选鱼腥草胰蛋白酶抑制剂的提取工艺［J］.时珍国医国药,2007,18(10):2337.
       
       ［5］杜旭东,刘同祥,张宗申,等.超声波法提取胰蛋白酶抑制剂［J］.时珍国医国药,2008,19(3):525.