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       【摘要】 
       目的探讨美曲磷酯对血管性痴呆大鼠学习记忆的影响。方法采用两血管阻断法制作大鼠血管性痴呆模型，大鼠随机分为假手术组、血管性痴呆模型组、脑复康(100 mg·kg-1·d-1，ig×60)阳性药物对照组、美曲磷酯(7 mg·kg-1·d-1，ig×60)治疗组。Morris水迷宫检测大鼠学习记忆能力，定位航行实验以逃避潜伏期及游泳总路程反映其学习成绩，空间探索实验以大鼠穿越平台次数、有效区停留时间及游泳总路程反映其空间记忆成绩;显微镜观察大鼠海马脑区组织结构改变。结果模型组大鼠逃避潜伏期、游泳总路程均明显大于假手术组(P<0.05)，有效区停留时间和穿越平台次数显著减少(P<0.05)。美曲磷酯能显著缩短血管性痴呆大鼠逃避潜伏期、游泳总路程(P<0.05)，与脑复康效果相似而与假手术组处于同一水平;同时使血管性痴呆大鼠穿越平台的次数增加及有效区停留时间延长(P<0.05)而与假手术组接近，脑复康则对血管性痴呆大鼠穿越平台的次数及有效区停留时间无明显影响。病理学观察显示模型组大鼠海马各区细胞排列疏松、紊乱，细胞层及细胞数明显减少，细胞变性严重;美曲磷酯组则细胞排列紧密、均匀，细胞层及细胞数明显增多，细胞变性减轻与脑复康组形态变化相似。结论美曲磷酯可改善血管性痴呆大鼠的学习记忆能力，且改善空间记忆能力优于脑复康。
       【关键词】  血管性痴呆; 美曲磷酯; Morris水迷宫; 海马; 学习记忆
       Effects of Metrifonate on Learning and Memory of Rats with Vascular Dementia
       CHEN Bin1, SHEN Taiyun1, CAI Li1, WANG Banghua2, ZHAO Ji2, CHEN Hongguang2, ZHENG Min2*
       (1. Grade 2005,the Undergraduate of Clinical Medical College,Xianning University, Xianning 437100, China; 2.The Center for Medical Research, Xianning University, Xianning 437100, China)
       Abstract:ObjectiveTo study the effect of metrifonate on learning and memory of rats with vascular dementia.MethodsThe VD rat model was established by 2VO occlusion.The wistar rats were randomly divided into sham operation group, vascular dementia model group，the metrifonate treatment group(7 mg·kg-1·d-1，ig×60) and piracetam group(100 mg·kg-1·d-1，ig×60). The ability of learning and memory was analyzed by Morris water maze test.The learning score was observed by stage of latency and pathway in the place navigation test, and the space memory was checked by the times that acrossed the target and the time stay in coverage area and pathway in the probe test. The hippocampal morphological changes were observed by microscope. ResultsCompared with sham operation group, stage of latency and pathway of vascular dementia model group increased(P<0.05).The time of acrossing coverage area and the times acrossing the target were declined(P<0.05).Stage of latency and pathway of rats with vascular dementia that treated by metrifonate was more shorter(P<0.05), similar with the sham-operation group and on the same level with piracetam group,and the time of acrossing coverage area and the times acrossing the target were increased markedly(P<0.05) but showed no difference as compared to sham operation group; the time of acrossing coverage area and the times acrossing the target of rats with vascular dementia that treated by piracetam had little change.Pathological observation showed that the number of necrosis in hippocampal area was reduced and the disorder in VD model group rangement compared with model group,metriforate could significantly improve the pathological changes of hippocampal neurons,whicth was similar with piracetam.ConclusionMetrifonate can improve the ability of learning and memory of the rats with vascular dementia, and improve the ability of space memory more remarkablly than piracetam group does.
       Key words:Vascular Dementia; Metrifonate; Morris water maze test; Hippocampus; Learning and memory
       血管性痴呆 (Vascular Dementia，VD)是老年性痴呆的常见类型之一，系由于缺血性或出血性脑血管病以及急、慢性缺氧性脑血管疾病引起。随着人口老龄化程度的加大，VD发病率呈上升趋势[1]，该病严重影响老年人生活质量，给社会和家庭带来沉重的负担，因而，进一步探讨其发病机制并寻求有效的药物日益受到关注。脑内胆碱能神经递质在人类学习和记忆过程中起重要作用，近来研究表明VD存在胆碱能神经系统失调紊乱[2],可能是导致痴呆的重要因素。美曲磷酯是目前用于老年痴呆(Alzheimer"s Disease,AD)治疗的唯一以无活性前体药物形式存在的AchE抑制药，对AD病人的综合能力和认知能力有很好的疗效[3];但对与AD发病机制上有一定相关性VD的研究和治疗，目前尚未见文献报道;本实验则应用大鼠VD模型，通过行为学检测，形态学观察以探讨美曲磷酯对血管性痴呆大鼠神经功能的影响，并为其是否可以作用为抗VD药物应用于临床提供实验和理论依据。
       1 材料与仪器
       1.1 动物选取健康年龄为912个月的雄性体质量为360400 g的Wistar大鼠80只，由湖北省实验动物研究中心提供,合格证号SCXK(鄂)2003-0005。
       1.2 试剂与仪器美曲磷酯(北流市新正兽药厂，批号20070612)，脑复康(湖北华中药业有限公司提供,批号20070303)。Morris水迷宫(成都泰盟科技有限公司)。医学图像分析系统(BI2000型, 成都泰盟科技有限公司)，生物显微镜(XSZ-HS7型，重庆光电仪器有限公司),电子分析天平(AUW120D型，日本岛津公司)。
       2 方法
       2.1 VD模型的制作、分组及给药 采用“改良两血管阻断”[4]制作大鼠血管性痴呆模型。术前禁食12 h，10%水合氯醛按350 mg/kg腹腔麻醉后，仰卧位，颈部备皮，碘伏消毒，取颈部正中切口，分离一侧颈总动脉，以4号丝线双重结扎，术后缝合切口。假手术组只分离一侧颈总动脉，而不结扎。术后碘伏消毒伤口3 d，3 d后再对另一侧颈总动脉进行相同的手术结扎。将造模成功的大鼠随机分为美曲磷酯组，脑复康组，模型组，每组20只， 美曲磷酯组药物剂量为7 mg/kg，脑复康组剂量100 mg/kg，模型组和假手术组给予等容积生理盐水，以上各组均按 5 ml/kg灌胃,各组用药60 d。
       2.2 行为学检测术后56 d开始行Morris水迷宫检测，历时5 d，实验开始前1 d，让大鼠在Morris水迷宫装置(撤去平台)中自由游泳1 min，以熟悉环境。前四天做定位航行实验，每次把大鼠依次从Morris水迷宫的4个象限的固定位置面向池壁投入水池中，每象限实验时间为120 s，记录大鼠从入水到找到并爬上平台的时间，这个时间称为逃避潜伏期(ST)，让其在平台上休息60 s后再进行下一象限的检测。如果在120 s内仍未能找到平台，则将其引导到平台，逃避潜伏期记为120 s，以第4天逃避潜伏期及游泳总路程作为其学习成绩(不同组大鼠选用任一相同象限成绩进行比较)。实验第5天行空间探索实验，撤走安全平台,将大鼠从某一固定象限如前操作投入水中,记录大鼠30s 穿过平台所在位置的次数和在水池中的游泳路径，以大鼠穿越平台次数、 有效区停留时间(以平台中心为圆心、平台半径1.5倍长度为半径的平台以外的一个圆环区域所停留的时间)及游泳总路程作为其空间记忆成绩。
       2.3 病理学观察行为学检测完毕后断头处死大鼠，取大鼠海马组织甲醛固定，然后作HE染色，光镜观察。
       2.4 统计方法Morris水迷宫实验潜伏期、穿越目标次数、路径等指标用SPSS13.0软件进行Independent-samples T Test检验,P<0.05时为有差异，有统计学意义。
       3 结果
       3.1 水迷宫实验模型组大鼠逃避潜伏期、游泳总路程均明显大于假手术组(P<0.05)，穿越平台次数和有效区停留时间显著减少(P<0.05)。美曲磷酯能显著缩短血管性痴呆大鼠逃避潜伏期、游泳总路程(P<0.05)，与脑复康效果相似而与假手术组处于同一水平;同时使血管性痴呆大鼠穿越平台的次数增加及有效区停留时间延长(P<0.05)而与假手术组接近，脑复康则对血管性痴呆大鼠穿越平台的次数及有效区停留时间无明显影响。见表12及图1。表1 各组VD大鼠定位航行实验的结果比较表2 各组VD大鼠30 s空间探索实验的结果比较
       3.2 病理学观察结果HE染色光镜下模型组大鼠海马CA1，CA2等各区细胞层层数较假手术组明显减少，空泡细胞增多，细胞排列稀疏。美曲磷酯组较模型组海马CA1，CA2区细胞层层数明显增多，空泡细胞减少，细胞排列紧密、均匀、整齐，较阳性药物脑复康组大鼠海马CA1，CA2区细胞层层数稍多，细胞排列亦较之紧密、均匀，少见空泡细胞。见图2。
       图2 各组大鼠海马组织(HE染色)结构变化
       4 讨论
       研究表明,乙酰胆碱与人类的学习记忆的关系非常密切,脑缺血可损伤脑部胆碱能神经，使Ach含量减少[5], 海马CA1区神经细胞严重水肿、变性，胞核固缩或崩解可能是导致大鼠空间学习记忆能力严重障碍的主要原因[6],美曲磷酯(metrifonate) 又称敌百虫,是一种有机磷化合物, 20 世纪80 年代被用来治疗AD,是目前用于AD治疗的唯一以无活性前药形式存在的AchE抑制药，服用数小时后转化为具有竞争性的不可逆的AChE 抑制剂敌敌畏(DDVP) 从而发挥长久疗效, 抑制Ach的水解，提高脑内特别是海马的Ach含量，而提高记忆力。本实验结果显示VD模型大鼠光镜下海马CA1，CA2等各区细胞层层数较假手术组明显减少，空泡细胞增多，细胞排列稀疏,神经纤维变性严重，给予美曲磷酯7 mg·kg-1·d-1灌胃治疗60 d后海马各区细胞层层数明显增多，空泡细胞减少，细胞排列紧密、均匀、整齐，较阳性药物脑复康(100 mg·kg-1·d-1，ig×60)大鼠海马CA1，CA2区细胞层层数稍多，细胞排列亦较之紧密、均匀，少见空泡细胞, 说明美曲磷酯能减少慢性脑缺血致痴呆大鼠迟发性神经元变性、死亡，对脑缺血后的神经元及神经纤维有保护作用,其疗效与脑复康相近甚至优于脑复康;水迷宫实验定位航行测试中，与VD模型组比较，美曲磷酯组VD大鼠的潜伏逃避期、游泳路径显著缩短，与脑复康效果相似而与假手术组处于同一水平，说明小剂量美曲磷酯与阳性对照药脑复康均能显著改善血管性痴呆大鼠的学习记忆能力;空间探索实验中，美曲磷酯治疗组大鼠较VD模型大鼠穿越平台次数增加、有效区停留时间明显延长而与假手术组接近，脑复康则对血管性痴呆大鼠穿越平台的次数及有效区停留时间无明显影响，表明小剂量美曲磷酯能有效提高VD大鼠的空间记忆能力其效果优于现有的阳性治疗药物脑复康。总之，本实验初步表明小剂量AChE抑制剂美曲磷酯可有效改善血管性痴呆大鼠神经元缺失及神经纤维变性，显著提高VD大鼠的学习和空间记忆能力，且在神经结构保护和改善空间记忆能力方面优于脑复康，具体疗效须结合其它实验模型及技术方法和临床实验进一步探究;同时进一步证实提高脑内Ach含量,增强胆碱能神经功能对于血管性痴呆患者的治疗不失为一条行之有效的途径。
       【参考文献】
         　[1] 闫 芳，李淑然，黄悦勤，等.北京市城市某社区近20年老年期痴呆患病纵向比较[J].中国心理卫生杂志，2008，22(2)：110.
       
       [2] Tomimoto H,Ohtani R,Shibata M,et al.Loss of cholinergic pathways in vascular dementia of the Binswanger type[J].Dement Geriatr Cogn Disord,2005,19(5-6):282.
       
       [3] 陈 军，余善强.美曲磷酯治疗阿尔茨海默病的疗效[J].国外医药·合成药·生化药·制剂分册，1999，20(2)：102.
       
       [4] 郑 敏，赵 骥，陈红光,等.大鼠血管性痴呆模型的改良[J].咸宁学院学报，2008，22(4)：277.
       
       [5] 于宝成,王玉敏,魏士贤.脑血管危险因素与Alzheimer病[J].国外医学·脑血管疾病分册,2003,11(5):374.
       
       [6] 黄 月，孙玉华，方树友.血管性痴呆大鼠的学习记忆及病理改变[J].Central Plains Medical Journal,2006,33(16):32.