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       【摘要】 
       目的参照中国药典(2005版)测定沙枣花(Elaeagnus angustifolia blossoms，EAB )中总黄酮和芦丁的含量，并初步探讨沙枣花醇提物(the alcohol extract of Elaeagnus angustifolia blossoms，AE-EAB ) 对四氯化碳(CCl4)诱导的小鼠急性肝损伤的保护作用。方法参考《中国药典》通过分光光度法和高效液相色谱法测定EAB中总黄酮和芦丁的含量，并通过测定小鼠血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)的活性和肝组织匀浆中丙二醛(MDA)的含量和超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)的活性及观察肝脏形态学改变，研究不同剂量AE-EAB对小鼠CCl4急性肝损伤模型的保护作用。 结果测得EAB中总黄酮的含量为27 mg/g，芦丁的含量为0.029 mg/g。与CCl4诱导的肝损伤模型比较, AE-EAB给药组小鼠血清中ALT,AST活性明显降低(P<0.05),同时小鼠肝组织中MDA含量明显下降(P<0.01),GSH含量有所升高(P<0.05), SOD活力明显增强(P<0.01)。形态学观察, AE-EAB能明显减轻CCl4对肝组织的损伤。结论EAB 含有黄酮类化合物，AE-EAB对CCl4诱导的小鼠急性肝损伤具有保护作用。
       【关键词】  沙枣花; 黄酮; 急性肝损伤; 四氯化碳
       Determination of the Contents of Total Flavonoids in Elaeagnus angustifolia Blossoms and its Pharmacological Actions
       WANG Jiyun1, YAO Yao1，2,XIAO Xu1, WANG Rui1,CHEN Hu1, ZHANG Zhenhua1 ,WANG Yan*
       (1.Basic Medical School Ningxia Medical University, Yinchuan 750004,China;2.Research Center of Medical Science and technology,Ningxia Medical University,Yinchuan,Ningxia 750004,China)
       Abstract：ObjectiveTo determine the contents of total flavonoids and rutin in Elaeagnus angustifolia blossoms(EAB)according to Technical Standard For Chinese Pharmacopoeia(2005 version) ,and to study the protective effects of the alcohol extract of Elaeagnus angustifolia blossoms(AE-EAB) on acute hepatic injury induced by carbon tetrachloride (CCl4) in mice.MethodsSpectrophotometric method and high performance liquid chromatography were used to determine the contents of total flavonoids and rutin in EAB，according to Technical Standard For Chinese Pharmacopoeia(2005 version). The levels of ALT,AST in serum and MDA , SOD and GSH in liver were measured and the hepatic histological changes were observed by optical microscope in order to study the protective effects of different doses of alcohol extract of AE-EAB on acute hepatic injury induced by 0.1% CCl4 in mice.ResultsThe content of total flavonoids of EAB is 27mg/g ( 27mg total flavonoids in 1g EAB ) , and that of rutin was 0.029 mg/g(0.029 mg rutin in 1g EAB). Compared with model group, the levels of ALT, AST in serum were obviously decreased (P<0.05), and the level of MDA in liver was also lowered (P<0.05), but the activities of GSH and SOD in liver were markedly improved (P<0.05，P<0.01) after pretreatment with AE-EAB.AE-EAB ameliorated the hepatic pathological changes too. ConclusionThe results show that EAB contains flavonoids, and AE-EAB has protective effects on acute hepatic injury induced by CCl4 in mice.
       Key words：EAB; Flavonoids ; Acute hepatic injury; Carbon tetrachloride
       沙枣花为胡颓子科植物沙枣Elaeagnus an gustifolia L .的花,主产于西北地区。宁夏沙枣树抗旱耐碱 ,具有很强的生命力 ,也是宁夏防风固沙的重要植物。沙枣花呈银白色，下垂，花呈漏斗形，长57mm。据《中药大辞典》记载 ,沙枣花主要含山萘酚、花白素、脂肪油和少量挥发油 ,具有止咳平喘的功能 ,可用于治疗慢性气管炎[1]。目前对沙枣花研究较多的是其挥发油成分[2]。本研究通过分光光度法测定了沙枣花醇提物中总黄酮的含量, 结果测得沙枣花中总黄酮的含量为27mg/g(即1g沙枣花乙醇提取物中含总黄酮27 mg);通过高效液相色谱法高效液相测定沙枣花乙醇提取物中芦丁的含量，结果测得沙枣花乙醇提取物中芦丁的含量为0.029 mg/g(即1g沙枣花乙醇提取物中含芦丁0.029 mg)，表明沙枣花中含有黄酮类物质。本文还对沙枣花醇提取物浸膏对CCl4所致小鼠急性肝损伤的保护作用做了初步研究,为进一步开发应用沙枣花提供一些实验依据。
       1 材料与仪器
       1.1 动物清洁级健康昆明种小鼠,雄性,体质量(20±2)g ，由宁夏医科大学动物实验中心提供,动物合格证号: SCXK(宁)2005-0001。
       1.2 试剂丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所);甲醇为色谱纯(天津市江天化工技术有限公司),水为超纯水,其它试剂均为分析纯。芦丁标准品(宁夏医科大学药学院提供) 。
       1.3 药材沙枣花采自宁夏医学院旁沙枣林，经宁夏区药品检验所中药研究室主任韩文欣鉴定为胡颓子科植物沙枣树Elaeagnus angustifolia L.的新鲜花序。
       1.4 仪器高效液相色谱仪(日立 MODELL-2100/2130);AllSPhere ODS C18(4. 6mm×250 mm)色谱柱;旋转蒸发仪(上海亚荣); SHB-III型循环式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司);KQ-3200 DE数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);Mili-Q超纯水仪(法国);电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司);721分光光度计(北京瑞利分析仪器公司);高速低温离心机(日立公司 CF16RX);恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司)。
       2 方法与结果
       2.1 分光光度法测定沙枣花总黄酮的含量[3]
       2.1.1 对照品溶液的制备精密称取在120℃干燥至恒重的芦丁对照品50 mg,置于25 ml量瓶中,加甲醇适量,置水浴上微热使溶解，放冷，加甲醇至刻度，摇匀。精密量取10 ml,置100 ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得(每毫升中含无水芦丁0.2 mg)。
       2.1.2 标准曲线的制备精密吸取标准溶液1，2.3，3，4，5，6 ml置25 ml量瓶中,各加亚硝酸钠溶液1. 00 ml,混匀,放置显色6 min,加10%硝酸铝溶液1 ml,摇匀，放置6 min，加氢氧化钠试液10 ml,再加水至刻度，摇匀，放置15 min，以相应试剂为空白，按照紫外-可见分光光度法在500 nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。其回归方程Y=10.31X-0.003 5,相关系数r=0. 998 5,线性关系良好。
       2.1.3 测定法取本品粗粉1g，精密称定，置索氏提取器中，加石油醚适量，加热回流至提取液无色，放冷，弃去乙醚液。再加甲醇90 ml，加热回流至提取液无色，转移至100 ml量瓶中，用甲醇少量洗涤容器，洗液并入同一量瓶，加甲醇至刻度，摇匀。精密量取10ml,至100 ml量瓶中，加水至刻度，摇匀。精密量取3 ml，置25 ml量瓶中，照标准曲线制备项下的方法，自“加亚硝酸钠”起依法测定吸光度，测得吸光度值为0.030，从标准曲线上算得供试品溶液中总黄酮的浓度为0.003 24 mg/ml，即算得沙枣花中总黄酮的含量为27 mg/g(即每克沙枣花中含有总黄酮27 mg)。
       2.2 RP-HPLC色谱法测定芦丁的含量[3]
       2.2.1 标准曲线的制备 取芦丁对照品溶液(0.1 mg/ml)分别进样,进样体积分别为1，2，4，6，8，10，35，40 μl,测定峰面积,以进样量为横坐标,峰面积A为纵坐标,得回归方程为A=6.9×109C+191 498,相关系数为r=0. 999 8,芦丁在0. 386.08 μg范围内成良好的线性关系。见图1。
       2.2.2 色谱条件色谱柱为ODS C18(4. 6 mm×250 mm),检测波长360 nm,柱温为室温(30℃),流速1. 0 ml/min,流动相为甲醇-水-冰醋酸(35∶62.4∶2.6 )。
       2.2.3 供试品溶液制备及芦丁的含量测定 取沙枣花粗粉1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 ml，称定重量，超声处理(功率250 W，频率25 kHz)30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，滤过。精密量取滤液5 ml，置25 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。用0. 45 μm微孔滤膜过滤,进样10 μl按“2. 1.1”项下色谱条件注入色谱仪,测峰面积。结果测得沙枣花乙醇提取物中芦丁的含量为0.029 mg/g(即每克沙枣花乙醇提取物中含芦丁0.029 mg)。见图2。
       2.2.4 沙枣花醇提物浸膏的制备1.0 kg沙枣花切碎后,加3倍量80%乙醇加热回流提取(1 h×3),合并滤液,减压浓缩,得121.3 g沙枣花浸膏。
       2.2.5 沙枣花浸膏最大给药剂量的测定[4]健康昆明种小鼠40只，1822 g，雌雄各半，分两组，沙枣花醇提物灌胃，0.4 ml/只(最大容积，最大耐受量)，给药前禁食10 h，正常饲水。观察14 d，记录小鼠一般状况改变及死亡数。结果发现，给药后1020 min呼吸加快，1 h后呼吸平稳。观察1周未见小鼠外观及行为有任何变化，未见小鼠死亡。因此灌胃最大耐受量为16.0 g/kg。
       2.2.6 CCl4诱导的小鼠急性肝损伤模型的建立[4]昆明种小鼠60只,雌雄各半,将小鼠随机分成6组,每组10只。分别为正常对照组，CCl4模型组，阳性药(联苯双酯滴丸)对照组(0.2 g·kg-1)、沙枣花浸膏高(16 g·kg-1)，中(8 g·kg-1)，低(4 g·kg-1)剂量组, 灌胃给药21 d,同时模型组和正常对照组分别给予同体积生理盐水。于第21天给药2 h后,每鼠ip 10 ml·kg-1,0.1% CCl4橄榄油溶液,正常对照组给等量的橄榄油溶液，禁食,不禁水。造模16 h后,眼球取血,血液3 000 r·min-1离心10 min,取血清超低温冰箱-80°冻存以备下一步检测所需。采血后,快速断头处死，取肝右叶组织0.5 g,在冰生理盐水中漂洗,滤纸拭干,用生理盐水制成10%肝组织匀浆,离心,取上清液待测。同时取左叶肝脏, 4%多聚甲醛固定作病理切片。
       测定指标：血清ALT、AST,按试剂盒要求进行测定;肝组织匀浆SOD、MDA和GSH,按试剂盒要求进行测定;取肝左叶同一部位组织,用常规石蜡包埋,切片,HE染色,光镜下观察肝组织的形态学变化。
       统计学处理：采用SPSS12.0统计软件，数据以±s表示。组间采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
       2.3 血清生化指标检测结果表明,皮下注射CCl4可引起小鼠急性肝损伤,表现在血清中ALT, AST活性明显升高。AE-EAB各剂量组均可使其升高的ALT,AST活性显著降低(P<0.05或P<0.01),提示AE-EAB对CCl4引起的小鼠急性肝损伤有很好的保护作用。 见表1。表1 AE-EAB对急性肝损伤小鼠血清ALT, AST的影响与正常对照组比较, *P<0.05， **P<0.01;与模型对照组比较, △ P<0.05, △△P<0.01;n=10
       2.4 肝组织匀浆生化指标检测 从实验结果可见,模型组小鼠肝组织中MDA含量明显升高(P<0.01), SOD与GSH活性显著下降(P<0.01),提示肝脏出现脂质过氧化。而AE-EAB各剂量组均可显著抑制肝组织中MDA的升高,而SOD, GSH活性明显升高(P<0.01或P<0.05),提示AE-EAB有较强的抗氧化及清除氧自由基的作用。结果见表2。表2 AE-EAB对急性肝损伤小鼠肝组织SOD,MDA和GSH的影响与正常对照组比较, *P<0.05， **P<0.01;与模型对照组比较, △P<0.05,△△ P<0.01
       2.5 肝脏组织病理学观察正常对照组小鼠肝脏外观呈红褐色,质地软而富有弹性;在光镜下可以观察到肝小叶结构完整,细胞排列整齐,大小均匀,分界清楚，无炎细胞浸润(图3-A)。模型组小鼠肝脏体积增大,质脆,边缘钝而厚,表面呈黄褐色，有暗红色出血点;镜下见肝小叶结构破坏,肝细胞核消失，出现以中央静脉为中心的局灶性肝细胞变性、坏死和大量炎细胞浸润(图3-B)。联苯双酯组(图3-F)和AE-EAB(图3-E)高剂量组肝脏略有水肿,质地柔软;镜下见肝小叶结构基本完整,细胞排列较整齐,只有少量的炎细胞浸润,较模型组有明显改善。AE-EAB(图3-D)中剂量与低剂量组(图3-C)与模型组相比变化不明显(图1)。
       3 讨论
       肝炎是一种发病率高,难以根治的疾病,对人类健康危害极大,而且不良的饮食习惯、外界环境等均能导致肝脏疾病,损害肝细胞。在肝细胞病变过程中,自由基、酶及脂质过氧化等均发挥重要作用[5]， CCl4是诱导化学性肝损伤的常用药物,在体内经肝脏细胞色素P450激活生成三氯甲基自由基(·CCl3)二氯甲烷自由基(·CCl2)等,引起膜的脂质过氧化,使肝细胞膜通透性增加,引起肝细胞严重受损,细胞内转氨酶易穿过细胞膜而释放入血液[6]。MDA是脂质过氧化降解的主要产物,其含量反映了组织脂质过氧化损伤程度的大小。SOD和GSH是细胞内主要的抗氧化酶类,可清除机体内过多的自由基,激活或调动机体中的内源性抗氧化系统,预防或减轻自由基损伤。MDA的测定常常与SOD的测定相互配合,SOD活力的高低间接反映了机体清除氧自由基的能力,而MDA的高低又间接反映了机体细胞受自由基攻击的严重程度[7，8],GSH广泛存在于人体的各种组织中，GSH水平降低意味着机体抗氧化能力下降并引发机体的氧化应激反应,产生大量的自由基。在肝脏化学性损伤时,氧化应激消耗GSH引起肝组织中GSH含量下降,机体抗氧化能力下降并引发机体的氧化应激反应[9]。大量实验表明[10]：各种黄酮类化合物如黄酮类、黄酮醇类、二氢黄酮类、异黄酮类、黄烷酮类等对化学性肝损伤、药物性肝损伤、免疫性肝损伤、酒精性肝损伤、缺血/再灌注性肝损伤等实验性肝损伤均有不同程度的保护作用，这种保护作用与黄酮化合物清除自由基、抗氧化、抗脂质过氧化反应、调节免疫功能等有关，本实验结果表明,沙枣花醇提物能降低CCl4诱导的急性肝损伤小鼠血清中ALT和AST的水平,减轻肝细胞的炎性浸润和变性坏死等病理改变,同时还明显降低肝组织中MDA的含量,并提高SOD和GSH的活力。降低机体内自由基的含量，提高机体的抗氧化能力。我们也对沙枣花醇提物做了总黄酮的测定，并用高效液相色谱法分析了沙枣花醇提物中芦丁的含量，发现沙枣花中含有黄酮类化合物。综上所述,沙枣花醇提物能够抑制自由基诱导的肝脏脂质过氧化损伤作用,提高机体清除氧自由基能力,维持细胞膜结构和功能的完整性, 从而对CCl4诱导的化学性肝损伤起一定的保护作用，但到底是不是沙枣花中的黄酮类物质对实验性肝损伤起保护作用以及其作用机制还有待进一步研究。
       【参考文献】
         　　[1] 南京中医药大学.中药大辞典，第2版，上册[M].上海：上海科学技术出版社 ，2006：1630.
       
       [2] 王 妍，李 玲，连松刚，等.顶空-固相微萃取气质联用分析宁夏沙枣花中香气成分[J].中草药，2007,38(11): 1627.
       
       [3] 国家药典委员会.中国药典，I部[S].北京：化学工业出版社，2005.
       
       [4] 徐叔云,卞如濂,陈修.药理实验方法学，第2版[M].北京:人民卫生出版社，1994:494.
       
       [5] 郑荣梁.自由基生物学，第3版[M].北京:高等教育出版社,2007.
       
       [6] Jeong HG，You HJ，Park SJ.Hepatoprotective effects of 18beta-glycyrrhetinic acid on carbon tetrachloride-induced liver injury: inhibition of cytochrome P450 expression [J].Pharmacol Res. 2002,46(3):221.
       
       [7] Mehmetcik G.Effect of pretreatment with artichoke extract on carbon tetrachloride-induced liver injury and oxidative stress[J]. Toxicol Pathol.2008,60(6):475.
       
       [8] Basn S. Carbon tetrachloride induced lipid peroxidation: eicosanoid formation and their regulation by antioxidant nutrien[J].Toxicology. 2003,189(1-2):113.
       
       [9] Mehmetcik G，Ozdemirler G，Kocak Toker N.Effect of pretreatment with artichoke extract on carbon tetrachloride-induced liver injury and oxidative stress[J].Experimental and Toxicologic Pathology 2008,60:475.
       
       [10] 郭 菁，杨秀芬.黄酮类化合物对动物实验性肝损伤保护作用的研究进展[J].中国药理学通报，2008，24(1)：5.