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       【摘要】 
       目的建立高效液相色谱(HPLC)法测定蒿鳖养阴软坚方中虎杖苷含量的方法。方法采用高效液相色谱法对制剂中的虎杖苷进行了定量分析，色谱柱Hypersil ODS2(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为乙腈水(21∶79)，检测波长：306 nm，流速1.0 ml·min-1。结果虎杖苷得到完全分离，在1.688～16.88 μg·ml-1范围内线性关系良好，r=0.999 9，平均加样回收率为101.0%，RSD为2.5%(n=6)。结论此方法可将虎杖苷从复方中充分的提取分离，专属性强，精密度和稳定性良好，结果准确，可用于蒿鳖养阴软坚方的质量控制。
       【关键词】  虎杖苷; 蒿鳖养阴软坚方; 高效液相色谱法
       蒿鳖养阴软坚方是由青蒿，鳖甲，虎杖，生地，丹参，白花蛇舌草等9味药组成，用于治疗阴虚血瘀、血热毒蕴证型的肝纤维化，临床疗效显著，对多种不同损伤所致的肝纤维化模型具有确切的抗肝纤维化作用。目前在中成药市场上还没有预防和治疗阴虚血瘀、血热毒蕴证型的肝纤维化的药物，因此研究该复方的质量标准对该新药的开发起到奠定基础作用。本文以虎杖苷为指标成分，建立了蒿鳖养阴软坚方中虎杖苷含量的HPLC测定法，以期为该方的质量控制提供客观的含量评价方法。
       1 仪器与试药
       1.1 仪器6000 LDI 型高效液相色谱仪(美国COMETRO公司)，6000PVW UV/VIS 紫外检测器(美国COMETRO公司)，EZChrom Elite分析工作站，AX205十万分之一天平(瑞士梅特勒托利多公司)。
       1.2 试药虎杖苷对照品(中国药品生物制品检定所，批号：111575200502);蒿鳖养阴软坚方(中新药业集团天津乐仁堂制药厂药研室制备，批号：070412，070522，070613)。乙腈为色谱纯;水为娃哈哈纯净水;其余试剂均为分析纯。
       2 方法与结果
       2.1 色谱条件色谱柱为Hypersil ODS2 (250 mm×4.6 mm，5 μm);流动相为乙腈水(21∶79);检测波长306 nm;流速1.0 ml·min-1;柱温为室温;进样量20 μl。
       2.2 对照品溶液的制备精密称取以五氧化二磷为干燥剂减压干燥24 h的虎杖苷对照品适量，置10 ml;棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成浓度为211μg·ml-1的对照品储备液。精密量取储备液2 ml置25 ml棕色量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液(浓度为16.88 μg·ml-1)。
       2.3 供试品溶液的制备取本品粉末约0.2 g，精密称定，精密加入稀乙醇25 ml称定重量，加热回流30 min，冷却至室温，再称定重量，用稀乙醇补足减失重量，摇匀，取2 ml上清液转移至10 ml棕色量瓶中，加稀乙醇稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜过滤即得。
       2.4 阴性对照溶液的制备根据处方组成，取除虎杖外的其余药味，按制剂工艺制备，制得缺虎杖的阴性样品粉末。按“2.3”项下方法处理制得阴性对照溶液。
       分别精密量取虎杖苷对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各20μl，注入液相色谱仪，按上述色谱条件进行测定，结果在306 nm波长下供试品中虎杖苷色谱峰与其他组分达到基线分离，与相邻的色谱峰分离度大于1.5，理论塔板数按虎杖苷计不低于3 000。结果见图1。
       2.5 线性关系考察精密量取虎杖苷对照品溶液(浓度为16.88 μg·ml-1)1，2，3，5，7 ml分别置10 ml棕色量瓶中，加甲醇稀释至刻度，配制成浓度分别为1.688，3.376，5.064，8.44，11.816，16.88 μg·ml-1的系列对照品溶液，摇匀，分别精密量取20 μl注入液相色谱仪，测定虎杖苷峰面积值，以峰面积积分值(Y)对对照品浓度(X)进行线性回归，得回归方程：Y=3.750 8×107X-2.601 7×103， r=0.999 9。结果表明虎杖苷对照品浓度在1.688～16.88 μg·ml-1范围内与峰面积值呈良好的线性关系。
       1.虎杖苷
       图1 虎杖苷对照品(A)、复方供试品(B) 、
       阴性样品溶液(C)的HPLC色谱图
       2.6 精密度实验精密量取同一对照品溶液(8.44 μg·ml-1)，重复进样5次，20μl/次，记录虎杖苷峰面积，结果虎杖苷峰面积值的RSD为0.86%(n=5)，表明精密度良好。
       2.7 稳定性实验取同一供试品溶液(批号：0705022)，分别于 0，2，4，6，8，10 h 进样测定，结果虎杖苷峰面积值的RSD为0.87%，表明供试液在10 h内峰面积基本稳定。
       2.8 重复性实验取同一批号样品(批号：0705022) 6份，按照“2.3”项下方法操作，按上述色谱条件测定虎杖苷峰面积，结果虎杖苷峰面积值的RSD为3.4%。证明此方法重复性良好。
       2.9 加样回收率实验精密称取已知虎杖苷含量的样品(批号：0705022，虎杖苷含量为3.693 mg·g)6份，每份约0.1 g，加入对照品溶液(501 μg·ml-1)1 ml，按“2.3”项下方法操作，精密吸取20μl进行测定，计算回收率。结果见表1。表1 虎杖苷加样回收率实验结果
       2.10 样品含量测定取 3 批样品，按供试品溶液的制备方法制备供试液，各进样 20 μl，计算虎杖苷的含量。结果见表2。　表2 样品含量测定结果
       3 讨论
       虎杖具有活血定痛、清热利胆等作用。虎杖苷作为虎杖的主要成分之一，被《中国药典》(2005年版)新增为虎杖药材的定量指标[1]，具有抗脂质过氧化损伤而保肝的重要药理作用[2]，故以虎杖苷作为定量指标具有重要意义。
       虎杖苷在光照条件下不稳定，容易分解，故实验需避光操作[3, 4]。
       虎杖苷易溶于甲醇、乙醇、丙酮、热水，在提取过程中考察了以甲醇、无水乙醇、稀乙醇为溶剂，分别进行超声[5]、回流[6]提取。结果发现，稀乙醇回流提取30 min效果最好，样品回收率高，并且方法简便，易于操作。
       本制剂为复方制剂，有效成分较多，参照2005版《中国药典》Ⅰ部以乙腈-水(23∶77)为流动相[1]虎杖苷峰受到其他成分干扰，分离度较差，通过调节比例，采用乙腈-水(21∶79)为流动相，分离度较好，色谱系统稳定。该色谱系统重复性和精密度均好，适用于蒿鳖养阴软坚方中虎杖苷的定量分析。
       【参考文献】
         　[1] 国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部[S].北京：化学工业出版社，2005：145.
       
       [2] 高守红，杨少麟，范国荣.虎杖苷的研究进展[J].药学实践杂志，2005，23(3)：145.
       
       [3] 齐 辉，张 勉，王峥涛.HPLC同时测定虎杖中4种成分的含量[J].中国中药杂志，2006，31(23)：2003.
       
       [4] 王 健.小儿肾炎颗粒质量标准研究[J].中成药，2007，29(12)：附10.
       
       [5] 王云霞，王 梅.乙肝清热解毒胶囊中虎杖苷的含量测定[J].现代中医药，2008，28(4)：65.
       
       [6] 马果玉，秦 洁，于 涛.护肝宁片质量标准研究[J].中成药，2007，29(8)：附10.