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       【摘要】 
       目的对微波辅助提取野菊花总黄酮的工艺条件及参数进行优化。方法在单因素实验的基础上, 采用L9(34)正交设计, 以野菊花总黄酮的提取率为指标, 探讨料液比、微波辅助提取时间、乙醇浓度、微波功率对提取率的影响。结果最佳提取工艺参数为: 料液比1∶50，提取时间9 min，乙醇浓度(φ)=60 %，微波功率340 W。在上述最优条件下进行了精密度和回收率实验, 所得结果的相对标准偏差为1.9 % ( n =6) , 回收率在97.5 %～101.4 %之间。结论采用微波辅助提取野菊花总黄酮工艺简单可行, 为进一步的工艺开发提供了参考。
       【关键词】  野菊花; 总黄酮; 微波辅助提取; 正交实验
       野菊花是菊科植物野菊Chrysanthemum indicum L.的干燥头状花序。近年来研究表明，野菊花含有黄酮类物质。黄酮类化合物是自然界中广泛存在的一类天然产物，药理学研究表明其具有抗炎[1]、抗氧化[2，3]、抗过敏作用[4]以及降低血液和肝脏中胆固醇的作用[5]。提取黄酮的方法有：热水提取法、有机溶剂提取法、碱液提取法、超声波辅助提取法、超临界流体提取法、大孔树脂吸附法、酶法提取等[6]。但对野菊花总黄酮的微波辅助提取研究报道较少。
       微波提取技术利用微波能快速破坏细胞壁加快活性成分的溶出，而且使许多难溶物质在微波电磁场的作用下得到较好的溶解，从而提高了提取的速度和产率[7～10]。与常规方法比，微波提取具有选择性高、快速高效、溶剂消耗少、活性成分提取率较高、不产生噪音、适合于热不稳定物质的提取等特点[11，12]。
       为更有效地开发和利用野菊花药材资源，充分提取野菊花中所含的总黄酮成分，本文采用正交设计的方法进行了微波辅助提取工艺研究，以期改善传统的浸提方法，为进一步的开发利用提供参考。
       1 材料与仪器
       1.1 材料芦丁对照品(中国药品生物制品检定所);野菊花(广州致信中药饮片有限公司)购自广东药学院附属门诊部药房;实验用水为双蒸水;所用试剂均分析纯。
       1.2 仪器MSP-100E 微波提取仪(北京雷明科技有限公司);U3010紫外可见分光光度计(日本日立公司);722型光栅分光光度计(上海精密科学仪器有限公司);FZ102微型植物粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司);HH-6电子恒温水浴锅(苏州威尔试验用品有限公司);FA2104电子分析天平(上海天平仪器厂)。
       2 方法与结果
       2.1 标准曲线的制备称取在120 ℃干燥至恒重的芦丁对照品0.200 0 g，置于100 ml 量瓶中，加乙醇70 ml，置于水浴上微热使溶解，冷却至室温，加甲醇至刻度，摇匀。精密吸取10 ml，置于100 ml 量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得0. 2 mg/ml 芦丁对照品溶液。精密量取对照品溶液0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0 ml，分别置25 ml量瓶中，加乙醇至6 ml，加ρ(NaNO2)=5 %亚硝酸钠溶液1.0 ml，混匀，放置6 min，加ρ[Al(NO3)3]= 10 %硝酸铝溶液1.0 ml，摇匀，放置6 min，加ρ(NaOH)=5 %氢氧化钠试液10.0 ml，再加水至刻度，摇匀，放置15 min。以乙醇为参比，用1 cm比色皿，于U3010紫外可见分光光度计上，在400～600 nm 波长处进行扫描。结果表明，对照品溶液在510 nm 处有最大吸收，因此选择510 nm 作为测定波长。在510 nm 波长处测定体系的吸收度，以吸收度(A)为纵坐标、浓度ρ芦丁(μg/ml)为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程A=0.0136 ρ芦丁+ 0.006 28 (r=0.999 4)。结果表明，芦丁对照品在所试浓度0.00～56.00 μg/ml范围内呈良好的线性关系。
       2.2 提取溶剂的选择
       2.2.1 水提取称取野菊花粉末1.000 0 g于特制的微波提取罐中，加水40 ml，浸泡30 min 后，控制一定压力，在微波功率255 W下提取9 min。趁热过滤至100 ml容量瓶中，药渣用少量水洗涤3次，每次过滤。并入滤液，冷却，用水定容后备用。
       2.2.2 乙醇提取称取菊花粉末1.000 0 g于特制的微波提取罐中，加φ=50 %乙醇40 ml，混匀，浸泡30 min 后，控制一定压力，在微波功率255 W下提取9 min。趁热过滤至100 ml容量瓶中。药渣用少量乙醇洗涤3次，每次过滤。并入滤液，冷却，用乙醇定容后备用。
       2.2.3 样品液总黄酮含量测定 移取样品液3.00 ml于25 ml容量瓶中，按标准曲线制备方法进行操作、显色，测定吸光度，由标准曲线得到样品中总黄酮含量。结果见表1。由表1可知，以乙醇作溶剂的提取法优于以水为溶剂的提取法。用水做溶剂提取黄酮虽然存在生产成本低，无溶剂残留的优点，但存在提取率较低，提取液存放易腐败变质，后续的过滤、浓缩操作困难且费时等不足，因此本实验选择乙醇作为提取溶剂。表1 提取溶剂与总黄酮产率的关系
       2.3 微波辅助提取单因素实验称取一定量的野菊花粉末，按照“2.2.2 ”项实验方法，采用单因数变换法分别试验料液比、微波辐射时间、乙醇浓度、微波辐射功率对野菊花总黄酮提取率的影响。
       2.3.1 料液比对野菊花总黄酮提取率的影响 以φ=50 %乙醇为提取溶剂，微波功率255 W，在微波辐射时间为9 min时，试验不同料液比对野菊花总黄酮提取率的影响。在料液比分别为1∶10～1∶80条件下进行提取，分别测定黄酮提取率。结果见图1。由图1可以看出，随着提取液用量的增加，野菊花总黄酮提取率增加。提取率增加可分为两个阶段：1∶10～1∶30为低产率阶段，提取率增幅较大;1∶40～1∶80为高产率阶段，到达1∶50时提取率基本上达到最高。当料液比超过1∶40后则提取率趋于平稳，提取率增幅很小。一般来说，料液比越大，提取率也越高。但料液比太大会给后处理工序增加困难，而且增加生产成本。在保证提取效果的同时，应尽量减少溶剂用量和降低蒸发浓缩负荷。综合经济效益和生产管理考虑，选择料液比为1∶40。
       图1 料液比对野菊花总黄酮提取率的影响
       2.3.2 微波辐射时间对野菊花总黄酮提取率的影响 在乙醇浓度为φ=50 %，料液比为1∶40，微波功率255 W时，试验不同微波辐射时间对野菊花总黄酮提取率的影响。当微波辐射时间为1～12 min时，分别测定总黄酮提取率。结果见图2。由图2看出，开始时随微波辐射时间的延长，野菊花总黄酮提取率增加，9 min时提取率最高;之后随微波辐射时间延长，总黄酮提取率呈下降趋势。可能由于微波辐射时间过长，使溶剂温度过高，破坏了野菊花提取物中的有效成分;也可能是高温使蛋白质凝固，造成黄酮不易溶出。选择微波辐射时间为9 min。
       图2 微波辐射时间对野菊花总黄酮提取率的影响
       2.3.3 乙醇浓度对野菊花总黄酮提取率的影响 在料液比1∶40，微波功率255 W，微波辐射时间为 9 min时，试验不同乙醇浓度对野菊花总黄酮提取率的影响。乙醇浓度(φ)在0 %～100 %范围内进行总黄酮提取，测定并计算总黄酮提取率。结果见图3。
       图3 乙醇浓度对野菊花总黄酮提取率的影响
       由图3看出，当乙醇浓度增大时，总黄酮提取率也随之提高，但乙醇浓度高于φ=60 %后，提取率有所下降。可能是由于高浓度乙醇使细胞内蛋白质凝固，影响总黄酮的溶出[13];同时因为黄酮糖苷是由两部分组成，苷元成分不易溶于水，而糖又易溶于水，因此在提取黄酮类化合物时，只有乙醇与水达到最佳比例时，提取率最高。而从提取液外观颜色看出，随着乙醇浓度增加(高于φ=80 %后)，提取液颜色加深，说明有其它色素物质被提取出来，这对后续测定可能会产生影响，故选择φ=50 %乙醇为提取浓度。
       2.3.4 微波提取功率对野菊花总黄酮提取率的影响在乙醇浓度为φ=50 %，料液比1∶40，微波辐射时间为 9 min时，试验不同微波提取功率对野菊花总黄酮提取率的影响。微波提取功率在85～425 W范围内进行总黄酮提取，测定并计算总黄酮提取率。结果见图4。由图4看出，可知255 W 以前总黄酮提取率随功率增加呈现上升，255 W后开始下降。因此选择微波功率为255 W。
       图4 微波功率对野菊花总黄酮提取率的影响
       2.4 提取工艺参数的优化在单因素实验的基础上，结合药材性质以及实际生产要求，以乙醇浓度、料液比、微波提取功率、微波辐射时间为考察因素，以野菊花总黄酮的提取率为评价指标，采用正交实验探索最优化条件。因素水平见表2，正交实验结果见表3。
       由表3的分析可知，各因素对野菊花总黄酮提取率的影响程度不同，其影响的主次顺序为A>C>B>D，即料液比>乙醇浓度>微波辐射时间>微波提取功率。由数据可以得出：料液比为显著影响因素，正交分析最优组合应为A3B2C2D3(即料液比1∶50，微波辐射时间9 min，乙醇浓度φ=60 %，微波提取功率340 W)。表2 正交实验因素水平表3 总黄酮提取工艺正交实验[L9(34)]结果
       2.5 最佳条件下的重现性和回收率实验
       2.5.1 重复性实验取同一批取菊花样品6份，在最佳条件下进行提取，分别测定各自的总黄酮含量，结果表明其相对标准偏差为1.9%。
       2.5.2 加标回收率实验准确称取一定量取菊花样品3份，加入不同量的芦丁对照品溶液在最佳条件下进行提取，提取物按实验方法进行显色，测定吸光度，计算回收率，结果表明回收率在97.5%～101.4 %之间，说明方法有较好的准确度。
       3 讨论
       探讨了微波辅助提取野菊花总黄酮的工艺条件，实验结果优于目前大量采用的热水提取，克服了热水提取时溶剂消耗大，提取率低的缺点。
       由于芦丁和黄酮类化合物的基本母核结构均为2-苯基色原酮，具有相同的吸光度测试性质，于510 nm处有最大吸收峰，因而可以采用芦丁为对照品来测定野菊花中总黄酮的含量。微波辅助提取野菊花总黄酮的正交实验表明：因素料液比的影响最大，其次为乙醇浓度、微波辐射时间，微波提取功率的影响最小。通过正交实验结果以及最优参数的验证试验，最佳提取工艺条件为A3B2C2D3，即料液比1∶50，微波辐射时间9 min，乙醇浓度φ=60 %，微波提取功率340 W。在此条件下，进行了精密度和回收率实验, 所得结果的相对标准偏差为1.9 % ( n =6) , 回收率在97.5 %～101.4 %之间。本实验采用的微波辅助提取野菊花总黄酮技术是一种快速、简便、提取率高的提取方法。优选出的工艺操作简单、稳定性好。
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