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       【摘要】 
       目的首次将一测多评分析方法应用于柴胡药材中柴胡皂苷a、c、d的含量测定，为柴胡药材多指标质量评价奠定基础。方法以柴胡皂苷a为对照品，建立药材中该成分与柴胡皂苷c及柴胡皂苷d的相对校正因子，利用校正因子计算柴胡皂苷c及柴胡皂苷d的含量，同时用外标法测定药材中3种成分的绝对含量，采用t-检验法对一测多评法的计算值与外标法实测值进行比较，评价一测多评法对柴胡药材中3种皂苷含量测定的准确性和科学性。结果在一定的线性范围内，柴胡皂苷a与柴胡皂苷c及柴胡皂苷d的相对校正因子分别为0.735，0.944，且在不同的实验条件下重现性良好(RSD=0.70%，0.56%);常规的外标法对柴胡皂苷c及柴胡皂苷d的实测含量与一测多评法计算的含量没有显著性差异，经统计学t检验，P>0.05，实验所得校正因子可信。结论该方法使用一个对照品可同时测定柴胡药材中3种柴胡皂苷的含量，为柴胡药材的多指标质量评价及控制提供了科学依据。
       【关键词】  一测多评; 高效液相色谱; 校正因子; 柴胡; 柴胡皂苷
       中药的质量评价和控制是制约中药现代化、国际化发展的关键问题之一，也一直是中医药研究的难点和热点。然而，由于中药本身的复杂性，现行以单一活性成分或指标成分定性定量分析为核心的质量控制模式，已不能适应全面控制中药质量的要求，多指标综合质量控制模式已成为中药质量评价和控制的发展趋势。由于多指标质量控制模式需要足够量的化学对照品，而中药化学对照品分离难度大，有些单体结构不稳定难以分离或分离成本过高等因素，致使中药多指标成分质量控制仅限于科研，在实际生产应用中很难推广。王智民等[1]利用中药有效成分内在函数和比例关系，提出了“一测多评”的想法，即只测定1个成分(对照品易得者)，来实现对多个成分(对照品没有或难以供应)的同步监控，并已成功运用于木通3种有效成分及人参与三七药材中多种人参皂苷含量的同步测定[1，2]。
       中药柴胡为伞形科(Umbelliferae)柴胡属(Bupleurum)植物, 柴胡Bupleurum chinense DC.(北柴胡)及狭叶柴胡B. scorzonerifolium Willd.(南柴胡)的干燥根，是一味疗效显著的常用中药，其主要活性成分为柴胡皂苷a、柴胡皂苷d及柴胡皂苷c，目前柴胡的质量评价主要以这3种成分作为指标[3～5]。由于柴胡皂苷结构复杂，在酸性条件下不稳定等，其对照品制备难度非常大，致使柴胡药材及制剂的质量难以准确控制。本文以柴胡皂苷a (SSa) 作为对照品，建立柴胡皂苷a与柴胡皂苷d (SSd)及柴胡皂苷c (SSc)的相对校正因子，并用相对校正因子计算柴胡皂苷d及柴胡皂苷c的含量。以统计学t-检验法对相对校正因子的计算值与外标法实测值进行比较，对不同品牌色谱柱、不同厂家的高效液相色谱仪及不同实验室的实验结果进行考察，综合评价一测多评法在柴胡药材中应用的准确性和科学性。
       1 仪器与试药
       Waters系列高效液相色谱仪，包括：Waters 600 controller，Waters 600 pump，Waters 2487 dual absorbance detector，Waters Empower 工作站。电子分析天平(上海天平仪器厂)，KQ5200B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，乙腈、甲醇为色谱纯(Fisher公司)。Wahaha纯净水(市售)，提取用甲醇为分析纯(北京化工厂)。
       柴胡皂苷a(批号110777-200406)和柴胡皂苷d(批号110778-200505)均由中国药品生物制品检定所提供，柴胡皂苷c由本实验室分离纯化，HPLC(面积归一化法)纯度>98%。柴胡药材收集自不同产地，经作者鉴定为北柴胡B. chinense DC.的干燥根。对照品结构式见图1。
       图1 柴胡皂苷a (1)，柴胡皂苷d (2) 和柴胡皂苷c (3)的结构式
       2 方法与结果
       2.1 方法原理 在一定的线性范围内成分的量(质量或浓度)与检测器响应成正比，即：W=f×A[6]。在多指标质量评价时，以药材中某一典型组分(有对照品供应者)为内标，建立该组分与其他组分之间的相对校正因子，通过校正因子计算其他组分的含量。这种测定一个成分，实现对多个成分定量的方法命名为一测多评法。
       假设某样品中含有i个组分，存在Wi/Ai=fi(i=1, 2,…,k,…,m)①。式中Ai为组分i的峰面积;Wi为i组分的量。选取其中一组分k为内标，建立组分k与其他组分m之间的相对校正因子，有fkm=fk/fm=(Wk×Am) /(Wm×Ak)②。由此可导出定量计算公式：Wm=(Wk×Am) /(fkm×Ak)③。式中Ak为内标物峰面积，Wk为内标物量;Am为组分m的峰面积，Wm为组分m的量。
       2.2 一测多评方法学考察
       2.2.1 色谱条件色谱柱为Venusi ASB-C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相：乙腈(A)-水(B)，梯度洗脱(0～50 min, 25→90% A;50～55 min, 90→90% A;55～60 min, 90→25% A;60～70 min, 25→25% A); 流速1.0 ml·min-1;柱温30℃;检测波长210 nm。在上述色谱条件下，SSc，SSa，SSd与其它峰能达到较好的分离。对照品及样品HPLC图谱见图2。
       2.2.2 对照品溶液的制备精密称定柴胡皂苷c、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d对照品1.02，2.05，2.39 mg置于同一2 ml量瓶中，用色谱甲醇定容，制得混合对照品溶液，于4℃保存备用。
       1.SSc 2.SSa 3.SSd
       图2 对照品(A)及样品(B)的HPLC图
       2.2.3 供试品溶液的制备取本品粉末(过60目筛)约0.5 g，精密称定，置50 ml三角瓶中，加入5%氨水甲醇溶液25 ml，密闭，于30℃水温超声处理30 min，滤过，滤渣用甲醇润洗两次，每次10 ml，合并滤液，回收甲醇至干。残渣加甲醇(色谱纯)溶解并转移至5 ml量瓶中，过0.45 mm的微孔滤膜，即得。
       2.2.4 线性范围精密吸取上述混合对照品溶液2, 5, 10, 15, 20 μl注入高效液相色谱仪，按“2.2.1”项下色谱条件进行分析。分别以对照品量C (μg)为横坐标，峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线并进行回归计算，得柴胡皂苷c、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的标准曲线回归方程及线性范围(见表1)，表明各化合物在相应范围内线性关系良好。　表1 线性关系实验结果
       2.2.5 校正因子计算以SSa为内标，按“2.1”项下公式②，分别计算SSa对SSc和SSd的校正因子，见表2。表2 SSa 对SSc和SSd的相对校正因子
       2.2.6 精密度实验精密吸取同一混合对照品溶液20μl，连续进样6次，记录SSc, SSa和SSd的峰面积，其峰面积的RSD分别为1.40%，1.30%和1.47%。表明仪器精密度良好，符合含量测定要求。
       2.2.7 稳定性实验取同一供试品溶液20 μl分别于0，2，4，6，8，10 h进样测定，记录SSc, SSa和SSd峰面积，其峰面积的RSD分别为1.70%, 2.00%和2.10%。表明SSc、SSa和SSd在10 h内稳定不变。
       2.2.8 重复性实验称取同一批柴胡药材粉末(60目)约0.50 g共6份,精密称定,按供试品溶液处理方法制备样品并测定, SSc, SSa和SSd含量的RSD(n=6)分别为1.20%, 2.94%和2.87%。表明实验方法重复性较好。
       2.2.9 加样回收率精密称取已知含量的柴胡药材粉末(60目)适量 6份，分别加入一定量的SSa对照品，按供试品溶液处理方法制备样品并测定，计算加样回收率，SSa的平均回收率为101.64%, RSD(n=6)为2.33%。表明实验方法准确度符合要求。
       2.2.10 样品测定分别精密吸取供试品、混合标准品各20μl注入高效液相色谱仪并测定。分别采用一测多评法和外标法计算柴胡药材中SSc、SSa和SSd含量(见表3)。表3 两种方法测定不同产地柴胡药材中3种皂苷含量
       2.3 一测多评方法耐用性和系统适应性评价
       2.3.1 色谱柱及高效液相色谱仪考察　取“2.2.2”项下混合对照品溶液，进样2, 5, 10, 15, 20μl，测定，按“2.2.5”项下计算SSa对SSc和SSd的校正因子。
       实验考察了Waters 600, Waters 2690两种高效液相色谱系统和Venusi ASB-C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm), Venusi MP-C18(4.6 mm×250 mm, 5μm)，Hibar RT-C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm) 3种色谱柱。结果见表4。表4 不同仪器和不同色谱柱测得的相对校正因子
       2.3.2 实验室考察采用建立的一测多评分析方法在两个实验室进行复核实验，结果表明两个实验室实验结果差异不大。见表5。表5 不同实验室测得的相对校正因子
       2.4 统计学方法 采用统计学t检验，对一测多评法与常规法得到的柴胡药材SSc和SSd含量进行比较，P>0.05，表明两种方法测得含量没有显著性差异。
       3 讨论
       本实验通过方法学验证、方法耐用性、系统适应性考察，对一测多评法用于柴胡药材3种皂苷含量测定的技术适用性和应用可行性进行了探讨。结果表明在不同色谱柱、不同仪器及不同实验条件下，柴胡皂苷a与柴胡皂苷c和柴胡皂苷d之间的相对校正因子(RCF)有较好的重现性(RSD分别为0.70%和0.56%)。用一测多评法计算的含量与常规的外标法测得的含量经统计学t-检验没有显著性差异，说明本研究所得的SSa对SSc与SSd的校正因子具有普适性。在本研究的色谱条件下，柴胡药材HPLC色谱图中色谱峰比较简单，可以通过SSa与SSc和SS d之间的相对保留时间差进行色谱峰定位，因此在定量柴胡皂苷a、c、d含量时，只要有柴胡皂苷a一个对照品，即可通过该方法实现3种成分同步含量测定。本实验所得的相对保留时间差RTSSa-RTSSc和RTSSa-RTSSd的平均值分别为3.7185和-5.9955 min，校正因子f SSa/SSc和f SSa/SSd的平均值分别为0.742和0.945，可供参考和使用。
       中药化学成分非常复杂，在不同色谱条件下有不同的色谱峰，在同一色谱条件下，其色谱峰的数量、出峰时间及峰形等也受色谱柱、仪器及溶剂系统等多种因素影响，因此如何将待测色谱峰准确定位，是“一测多评”方法能否成功应用的关健问题，需要进行深入广泛的研究。对于在一定色谱条件下，色谱峰相对较少的中药，可根据《中药注射剂色谱指纹图谱研究的技术要求(暂行)》[7]推荐使用相对色谱保留时间作为定性依据，根据内标峰的保留时间，加上相对保留时间差，再根据峰形，即能够正确判断出目标峰的峰位置。本实验采用这种方法，效果良好。对于同一色谱条件下，色谱峰较复杂的中药或复方制剂，可采用光谱相关色谱法进行色谱峰的定位，同一组分在不同色谱柱及色谱仪器中的保留时间存在差异，但他们的光谱(或质谱)相同或相似。王亚丽等[8]应用光谱相关色谱法实现了当归补血汤与其单味药中各组分的归属。当然，最好是使用少量的对照品对待测峰进行定性和准确定位后，采用相对校正因子计算含量是比较准确的。
       一测多评法用于中药多指标质量评价与控制才刚刚开始，相对较正因子在同结构类型、不同结构类型化合物及不同色谱条件之间的普适性如何以及待测色谱峰的定位等问题还需要深入的研究。尽管如此，该方法为中药多指标质量评价和控制提供新的研究思路和方法。
       【参考文献】
         　[1] 王智民，高慧敏，付雪涛，等.“一测多评”法中药质量评价模式方法学研究[J].中国中药杂志, 2006, 31(23): 1925.
       
       [2] 朱晶晶，王智民， 匡艳辉，等.一测多评法同步测定人参和三七药材中多种人参皂苷的含量[J].药学学报，2008，43(12)：1211.
       
       [3] 谢东浩，蔡宝昌，安益强，等. 柴胡皂苷类化学成分及药理作用研究进展[J]. 南京中医药大学学报,2007,23(1):63.
       
       [4] 林东昊，茅仁刚，王智华，等. 23种国产柴胡属植物中柴胡皂苷a、c、d含量的RP-HPLC测定[J].药物分析杂志，2004，24(5)：479.
       
       [5] 刘书芬，潘胜利. 多枝柴胡中柴胡皂苷a、c、d的动态积累规律[J].复旦学报(医学版)，2007,34(1)：144.
       
       [6] 李 聪.紫外检测器定量校正因子的性质与实用性探讨[J].色谱, 1990,8(4):255.
       
       [7] 国家药品监督管理局.关于印发《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》的通知[J].中成药,2000,22：671.
       
       [8] 王亚丽，梁逸曾，李博岩，等.当归补血汤中组分的变化及归属分析[J].中草药，2005，36(10)：1457.