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       【摘要】 
       目的观察抵当芪桂汤对链脲佐菌素(STZ)诱导糖尿病大鼠血清内皮素-1(ET-1)和一氧化氮(NO)的影响，探讨其防治糖尿病血管病变的作用机制。方法90只SD大鼠随机抽取10只为空白组(A，n=10)，其余大鼠予以链脲佐菌素(STZ)60 mg/kg一次性腹腔注射建立糖尿病大鼠模型。造模成功后，将模型动物随机分为模型组(B，n=13)、达美康组(C，n=13)、抵当芪桂汤组(D，n=13)、抵当芪桂汤加达美康组(E，n=13)、抵当芪桂汤大剂量组(F，n=13)，分别给予相应干预。于灌胃第8周末，分别用ELISA和硝酸还原酶法测定大鼠血清中ET-1和NO含量。结果干预结束后，与B组比较，各干预组空腹血糖(FBG)均降低，其中以C组最为明显(P<0.05);与B组比较，各干预组血清ET-1均降低、NO均升高，其中以D组最为明显(P<0.05);与C组比较，D组降低血清ET-1、升高NO疗效明显(P<0.05)。结论抵当芪桂汤可能通过降低STZ大鼠血清中ET-1含量、升高NO含量，保护血管内皮功能，阻止或延缓糖尿病血管病变的发生和发展。
       【关键词】  抵当芪桂汤; 糖尿病血管病变; 内皮素-1; 一氧化氮
       Effects of Didang Qigui Decoction on Endothelin-1 and Nitric Oxide in Serum of Diabetic Rats
       ZHAO Tiancai, YANG Jingfeng*, LI Peng, YUAN Zhimin, ZHANG Ying, LI Yuehong, ZHANG Hanyuan
       (Shanxi University of Chinese Medicine,Xianyang 712046, China)
       Abstract:ObjectiveTo observe the effects of Didang Qigui Decoction on endothelin-1(ET-1) and nitric oxide(NO) in serum of diabetic rats, and to further explore its mechanism of prevention and treatment of diabetic angiopathy. MethodsThe model of diabetes was established by intraperitoneal injection of Streptozotocin (STZ) at a dose of 60mg/kg. Experimental rats were randomly divided into six groups: blank group(A, 10 cases), model group(B, 13), diamicron group(C,13), Didang Qiqui Decoction group(D, 13), Didang Qigui Decoction and diamicron group(E, 13), Didang Qigui Decoction high-dose group(F, 13) and they were treated respectively. Eight weeks later, serum ET-1 and NO contents were determined through ELISA and nitrate reductase method respectively. Results (1)After treatment, FBG in each treatment group was decreased dramatically, especially in C group(P<0.05) compared with B group; (2) In each treatment group, ET-1 was decreased while NO was increased, especially in D group(P<0.05) compared with B and C group. ConclusionIt is possible that Didang Qigui Decoction protect vascular endothelial cells by reducing serum ET-1 content and increasing NO content and further prevent or delay the occurrence and development of diabetic angiopathy.
       Key words:Didang Qigui Decoction; Diabetic angiopathy; Endothelin-1; Nitric oxide
       糖尿病(diabetes mellitus, DM)是由于胰岛素分泌和(或)作用缺陷所引起的以慢性血葡萄糖(简称血糖)水平增高为特征的代谢性疾病[1]。微血管和大血管病变是糖尿病致死和致残的主要原因;而内皮细胞受损是血管病变的基础,保护血管内皮细胞是防止糖尿病并发症的关键[2]。内皮素(ET-1)和一氧化氮(NO)是判断血管内皮损伤的关键和主要的生物活性物质。抵当芪桂汤(原名抵当四五汤)是以仲景抵当汤合黄芪桂枝五物汤加减化裁而成，用于治疗糖尿病临床疗效肯定。本实验通过观察抵当芪桂汤对STZ诱导糖尿病大鼠血清ET-1、NO含量的影响，进一步探讨其保护血管内皮,防治糖尿病血管病变的作用机制。
       1 材料与仪器
       健康Sprague-Dawley大鼠90只，雌性，体质量(200±20)g/只，由西安交通大学医学院实验动物中心[许可证号：SCXK(陕)2007-001]提供。中药：抵当芪桂汤(生黄芪、炒白芍、酒大黄、桂枝、水蛭、鬼箭羽)，由陕西中医学院附属医院提供并进行制备煎液及水浴浓缩，按人与动物每千克体质量等效剂量折算系数[3]，计算大鼠等效剂量8.65 g/(kg·d)，按等效剂量1，2倍作为正常剂量(0.87 g/ml)和大剂量(1.73 g/ml)。达美康(diamicron，格列齐特)：80 mg/片，天津华津制药厂生产，批号080405。链脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)：美国Sigma公司;葡萄糖测定试剂盒：上海荣盛生物技术有限公司(批号：20081013); ET-1试剂盒：上海西唐生物科技有限公司(批号0810261);NO试剂盒：南京建成生物工程研究所(批号20081115)。722E型分光光度计：上海光谱仪器有限公司;1379型洗板机：北京宾达英创科技有限公司;全活力型罗康全血糖仪：德国罗氏诊断公司;RT-2100C型酶标仪：上海光达电器厂。
       2 方法
       2.1 实验分组及模型制备90只大鼠适应性喂养1周，随机抽取10只作为空白组(A组)，其余80只大鼠禁食12 h，腹腔内一次性注射链脲佐菌素60 mg/kg(STZ溶于0.1 mol/L、pH 4.2枸橼酸缓冲液中，配制成1﹪浓度);72 h后尾静脉采血测空腹血糖，血糖值≥16.9 mmol/L，尿糖(+++)以上为造模成功[4]。将造模成功的65只大鼠随机分为模型组(B组)、达美康组(C组)、抵当芪桂汤组(D组)、抵当芪桂汤加达美康组(E组)、抵当芪桂汤大剂量组(F组)，每组13只。各组大鼠造模后第4天开始灌胃给药，1次/d，连续8周。给药剂量分别为：A、B组：蒸馏水2 ml;C组：达美康(2 mg/ml)混悬液2 ml;D组：抵当芪桂汤(含生药量0.87 g/ml)浓缩液2 ml;E组：抵当芪桂汤(0.87 g/ml)浓缩2 ml，30 min后予达美康(2 mg/ml)混悬液2 ml;F组：抵当芪桂汤(含生药量1.73 g/ml)浓缩液2 ml。
       2.2 观察指标给药第8周末，10%水合氯醛腹腔注射麻醉动物，心脏取血分离血清。葡萄糖氧化酶法测定空腹血糖;酶联免疫吸附试验(ELISA)测定ET-1含量;硝酸还原酶法测定NO含量。
       2.3 统计学分析所有数据用SPSS16.0统计学软件进行分析，计量数据以±s表示，多组均数间比较用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
       3 结果
       3.1 治疗前后各组大鼠空腹血糖含量一次性腹腔注射STZ后，模型大鼠的FBG迅速升高，3 d后与空白组比较，明显升高(P<0.01)，表明造模成功，见表1。给予相应干预后，各组大鼠的FBG明显下降，其中以C组下降最为明显(P<0.05)。表1 治疗前后各组大鼠空腹血糖含量比较与A组比较，**P<0.01;与B组比较，#P<0.05
       3.2 各组大鼠血清ET-1、NO含量干预结束后，与B组比较，各干预组大鼠血清ET-1含量明显降低，NO含量明显增加，尤其以D组变化最为显著(P<0.05)。与达美康组比较，D组中ET-1含量降低、NO含量升高明显(P<0.05)。表2 各组大鼠血清ET-1 、NO含量比较与A组比较，*P<0.05;与B组比较，#P<0.05;与C组比较，△P<0.05
       4 讨论
       糖尿病患者由于糖、脂代谢、内分泌等功能紊乱造成血管内皮细胞损伤,常在心脏、肾脏、视网膜等脏器发生一系列血管性病变。糖尿病血管病变是一缓慢进展的过程，内皮细胞损伤是其早期的病理生理过程和始动因素。通过检测循环血中ET-1、NO含量的变化可间接反映内皮细胞功能。ET和NO是血管内皮细胞产生的一对相互拮抗的血管活性因子。ET-1具有很强的收缩血管，促平滑肌细胞增殖的作用[5],它主要通过与内皮素受体A结合而发挥其强烈的收缩血管作用[6]。当血管内皮细胞受损，ET-1释放增加，ET-1通过其收缩血管、刺激血管平滑肌细胞分裂增殖、损伤血管内皮促使其他血管活牲物质释放等作用导致血管并发症的发生、发展[7]。因此血浆ET水平升高是血管内皮损伤的标志[8]。NO是内皮依赖性舒张因子，在糖尿病血管病变中起重要作用[9]。NO是血管内皮细胞利用精氨酸合成的内源性血管扩张剂，在体内能使血管平滑肌细胞舒张、血管腔扩张[10]，也具有调节血流、抑制内皮细胞增殖和血小板聚集的功能，对血管内皮具有保护作用[11]。
       本实验成功复制了糖尿病大鼠模型，造模成功时模型大鼠空腹血糖明显升高。经过干预后血糖下降，其中达美康降糖作用显著，但在保护血管内皮方面未显示出良好的疗效。中药抵当芪桂汤能够降低STZ诱导糖尿病大鼠空腹血糖，正常剂量组疗效强于剂量组。在大鼠血管内皮功能的保护方面，中药组显示出较强的优势，能够降低糖尿病大鼠血清中ET-1的含量，升高血清中NO的含量，能够调节血管的舒缩功能，保护血管内皮功能。其中中药大剂量组和中药加达美康组疗效较差的原因考虑可能与大鼠的耐受性有关，应进一步研究。糖尿病血管病变可归属于中医“脉痹”“血痹”范畴。笔者认为，糖尿病血管病变系由久病阴液亏耗，脉管失于充盈，血流涩滞，瘀阻脉中，变证丛生。抵当芪桂汤是以仲景抵当汤和黄芪桂枝五物汤加减化裁而成，方中生黄芪益气，炒白芍养阴生津，二者合为君药，共奏益气养阴生津之效;酒大黄、水蛭化瘀通络，桂枝温通经脉，共为臣药;佐以鬼箭羽活血化瘀，使血行而不滞，有利于瘀血的祛除。诸药合用补益而不壅滞，活血而不伤正，共奏益气养阴，化瘀通络之功。药理研究也证实：黄芪可以增强组织对葡萄糖的摄取和利用[12]，可以调节多种细胞因子的活性;水蛭直接作用于凝血系统，可明显降低血清ET-1水平[13];大黄具有降低血糖、糖化血红蛋白，改善糖代谢的作用[14];桂枝可以改善内皮分泌功能。鬼箭羽亦有降低血糖和调节血脂的作用。前期研究[15]也显示其在改善糖尿病大鼠血管病变肿瘤坏死因子方面的良好作用。
       综上所述，通过测定血清中重要的血管活性物质ET-1和NO的变化，证实了糖尿病大鼠血管病变中上述重要的血管内皮功能性因子的含量改变和其功能失调，抵当芪桂汤通过调节这一对功能上相互拮抗的血管内皮活性因子来调节血管的舒缩功能，改善STZ诱导糖尿病大鼠血管内皮功能，从而对糖尿病血管病变的发生和发展起到重要的防治作用。
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