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       【摘要】 
       目的验证中药材当归提取物抗皮肤衰老能力和美白功效。方法对当归提取物的自由基清除、亚铁离子络合及酪氨酸酶活性抑制能力进行体外实验。结果各项功效指标与溶剂浓度及提取物浓度有一定的关联，其中当归50%醇提液自由基清除率最高达到80.2%，铁离子络合率最高达到41.4%，酪氨酸酶抑制率最高达到25.1%。结论当归提取物具有较好的抗皮肤老化和美白双重功效，可用作美白和抗衰老化妆品的天然原料。
       【关键词】  当归; 抗衰老; 美白; 体外实验
       皮肤衰老是人体机体的自然发展规律。随着对皮肤衰老机理的深入研究，人们不断的研究和总结预防和延缓皮肤衰老的有效途径和方法。中草药因其独特机理和美容效果已被广泛应用于护肤类化妆品中。
       当归为伞形科植物当归Angelica sinensis (Oliv.) Diels的干燥根，是临床常用药，素有“十方九归”之称。性味甘、辛、温，归肝、心、脾经。内服有补血活血，调经止痛，润肠通便的功效[1]。
       现代药理学研究进一步发现，当归还具有抗炎、清除氧自由基、增强免疫功能等作用[2]。动物实验研究已表明含复方当归提取物水剂型护肤品具有增加小鼠表皮含水量和提高小鼠皮肤细胞SOD活性;人体试验研究显示它具有改善人体皮肤颜色，增加皮肤白皙、透明效果[3]。这些新的功效在护肤化妆品研发当中得到了重视和应用。
       本研究主要通过体外实验，从自由基捕捉效应、络合亚铁离子能力及酪氨酸酶活性抑制三方面对当归提取物抗皮肤老化与美白能力进行评估，并对体内实验结果进行检验和佐证。
       1 材料与仪器
       当归购自广州市清平药材市场，经广东省中药研究所药物研究室鉴定。
       DPPH (1,1-diphenyl-2-2-picrylhydrazyl radical)、菲咯嗪(5 mmol/L)、酪氨酸酶(用PBS配制成相应浓度单位)均为sigma公司生产。
       甲醇、FeCl2·4H2O(2 mmol/L)、熊果苷，EDTA，VitE，磷酸二氢钠，磷酸氢二钠等试剂均为国产分析纯，配制水均为双蒸水。
       752型紫外分光光度计，旋转蒸发仪，恒温水浴锅，真空减压泵、中药粉碎机、离心机。
       2 方法
       2.1 中药的提取
       2.1.1 水提法当归100 g→破碎→烘干(80℃)→粉碎(40目)→用双蒸水浸提(分3次进行，3次加水量分别是当归重的10，6，4倍;每次浸提温度为100℃，时间30 min)→合并3次浸提液→离心(1 500 r/min，30 min)→滤液→离心(10 000 r/min，15 min)→滤液→旋转蒸发→当归浓缩液→定容。
       取定容液配制成0.5%，1.0%，2.0%等3种不同浓度。
       2.1.2 醇提法将浸提液调整为50%乙醇或95%乙醇进行萃取，方法同“2.1.1”项。
       2.2 抗老化能力的测定
       2.2.1 DPPH自由基清除能力测定DPPH为含有奇数电子的稳定自由基，本方法的原理是利用其甲醇溶液在517 nm可见光下具有极强的吸光度，但当其与任一自由基结合或被抗氧化剂还原时，其吸光度会下降;吸光度越低，表示样品清除DPPH的能力越强。
       取0.2 ml萃取物、3.8 ml甲醇溶液与1 ml(DPPH)radical甲醇溶液(2×10-4mol/L)，充分混和均匀，静置30 min后，以分光光度计测517 nm处吸光度，并以公式计算其自由基清除率[4]。
       自由基清除率(%)=[(Ac-As/Ac)]×100%
       As：含有待测物的样品在517 nm处的吸光度;
       Ac：不含待测物的样品在517 nm处的吸光度。
       2.2.2 络合亚铁离子能力Fe2+通常为较好的促氧化剂，可以促使脂质氧化作用的进行。本方法利用Fe2+与Ferrozine(菲咯嗪)的复合物在562nm处有呈色反应，可测得样品对Fe2+的络合能力。当样品络合Fe2+会造成吸光度降低，吸光度越高表示络合能力越好[5]。
       络合率(%)=[1-AsAc]×100%
       As：含有待测物的样品在562 nm处的吸光度;
       Ac：不含待测物的样品在562 nm处的吸光度。
       取不同浓度的萃取液加入0.1 ml的FeCl2·4H2O(2mmol/L)30 s后再加入0.2 ml Ferrozine(5mmol/L)，反应10min后，使用分光光度计检测吸光度，空白试验(Blank)以样品溶剂取代样品。
       2.3 美白有效性试验—当归提取物对酪氨酸酶活性抑制的影响
       2.3.1 处理组(萃取液)探讨不同萃取物对抑制酪氨酸酶形成Dopaquinone的能力，并以维生素E(VitE)作对照组。取1 ml的中药萃取液，加入0.9 ml pH 6.8的缓冲液及1 ml 0.03%的酪氨酸溶液于试管中混和，并置于37℃的恒温槽中10 min，再加入0.1ml的酪氨酸酶(350units/ml)水溶液，将溶液混和均匀，置于恒温槽中反应25 min后，以紫外分光光度计测定475 nm时的吸光度(B)[6,7]。
       2.3.2 空白组步骤与处理组相同，但以等体积的磷酸缓冲液取代酪氨酸酶溶液(B0)。
       2.3.3 对照组步骤与处理组相同，但以等体积萃取液所使用的溶剂取代萃取液(A)。
       2.3.4 总空白组步骤与处理组相同，但以等体积萃取液所使用的溶剂取代萃取液，以等体积的磷酸缓冲液取代酪氨酸酶溶液(A0)。
       抑制率(%)=(A-A0)-(B-B0)(A-A0)×100%
       A：处理组样品在475 nm处的吸光度;
       A0：空白组样品在475 nm处的吸光度;
       B：对照组样品在475 nm处的吸光度;
       B0：总空白组样品在475 nm处的吸光度。
       3 结果与讨论
       3.1 中药萃取物抗氧化、抗老化功效评估
       3.1.1 当归提取物清除自由基效果自由基是生命活动过程中生物化学反应的中间产物。在正常情况下，机体内自由基的产生和清除处于动态平衡之中，但它若在体内产生过多或清除过慢，就会在分子水平、细胞水平以及器官水平给机体造成损伤，并可加快机体的衰老过程。与生命老化有关的生物自由基主要是一些含氧的自由基，如活性氧自由基(O2-·)、过氧化氢自由基(HO2·)、羟基自由基(·OH)等。抗氧化剂可提供质子给过氧化物自由基，因而能够抑制脂质自氧化的连锁反应。(DPPH·+AH(抗氧化剂)→DPPH+HA·)通常使用DPPH·(C18H12N6O5)来检验抗氧化剂提供质子的能力。DPPH·是一种很稳定的自由基，其甲醇溶液在517nm处有极强的吸光度，但当被氧化剂(AH)或自由基(R·)还原时，其吸光度会降低或消失。由此，可利用样品在517nm处的吸光度来判定样品是否有清除自由基的能力。
       图1 当归提取物清除自由基实验(n=3)
       本实验以纯水、50%乙醇、95%乙醇萃取当归，以Vit E做参照，比较不同浓度的提取液清除DPPH自由基的能力。见图1，以纯水萃取时，萃取液浓度低时清除自由基的能力反而较好，2%浓度不但没有清除效果反而有促进自由基生成作用;50%乙醇和95%乙醇萃取时，萃取液浓度越高清除自由基能力越强。萃取的2%浓度当归以50%乙醇提取物自由基清除率可达到80.2%。水提与醇提组的结果正好相反。推测原因可能是因为当归中的清除自由基有效成分在极性溶剂中溶出较多，所以实践中最好采用醇提方式，50%乙醇的提取液优于95%乙醇提取液清除自由基效果。
       3.1.2 当归提取物络合亚铁离子能力
       金属离子在自由基连锁反应中具有促进脂质氧化的作用，通常与Fenton 反应及Harber-Weiss 反应有关。络合剂没有抗氧化能力，但有一对未共用电子对，可与过渡金属(Fe2+，Cu2+)结合，因而能够减少氧化反应进行。如萃取物中含有络合亚铁离子的成分，就可减少紫外线照射皮肤所引起的自由基生成反应。
       图2 当归提取物络合亚铁离子能力比较(n=3)
       本实验以纯水、50%乙醇、95%乙醇萃取当归，以EDTA做参照，比较不同浓度的提取液络合亚铁离子的能力。见图2，当归提取物具有络合亚铁离子的能力;不同溶剂萃取的各种浓度萃取液，在较高浓度时有较好的络合能力，其中以50%乙醇萃取的2%浓度当归提取物络合能力最强，络合率为41.4%。
       3.2 当归提取物美白功效评价-酪氨酸酶抑制实验黑色素的形成过程中，酪氨酸酶起了关键酶的作用，黑色素产生的多少与酪氨酸酶的活性有直接的关系。因此，皮肤美白剂就是通过作用于皮肤黑色素生成，代谢过程中，抑制黑色素生成且符合安全规范的物质[8，9]。
       由于酪氨酸酶分别作用于酪氨酸转化为DoPa和Dopaquinone两个过程，目前的皮肤美白剂就是通过抑制酪氨酸酶活性或者阻断酪氨酸生成黑色素的氧化途径，从而减少黑色素的生成达到美白皮肤的效果。
       本实验以纯水、50%乙醇、95%乙醇萃取当归，以熊果苷做参照，在37℃、pH6.8的条件下反应30min比较不同浓度的提取液抑制酪氨酸酶活性能力。见图3，当归水提液抑制酪氨酸酶活性较低，甚至在较高浓度时有激活作用。醇提液具有抑制酪氨酸酶活性作用，并均表现为浓度高时有较高的抑制效果。水提液与醇提液酪氨酸酶抑制与激活能力的不同，同样可考虑为对酶氨酸酶有抑制作用的阿魏酸、当归多糖等有效物质在极性醇溶液中溶出较多的原因。50%乙醇萃取的2.0%浓度当归提取物酪氨酸酶抑制率达到25.1%。
       图3 当归提取物抑制酪氨酸酶活性能力比较(n=3)
       本研究从当归提取物具有清除自由基和络合亚铁离子能力两方面来验证其具有抗老化能力，从当归提取物对酪氨酸酶的抑制能力方面来验证其美白作用。
       综上所述 ，当归提取液有望作为美白化妆品和抗衰老化妆品的天然原料，此研究为当归在化妆品方面的开发利用提供了实验数据。
       【参考文献】
         　[1] 国家药典委员会. 中国药典，Ⅰ部[S].北京：化学工业出版社，2005：1.
       
       [2] 邹志东 陆 胡. 复方当归提取物皮肤美白作用机理实验研究[S]. 首届中国中医药美容学术交流大会论文汇编, 2000：62.
       
       [3] 陆 绮, 赵 晖, 穆 阳. 复方当归提取物对皮肤抗氧化作用实验研究[J].中国美容医学,2007, 16(11):1574.
       
       [4] Shimada K., Fujikawa, K., Yahara, K. and Nakamura, T. Antioxidative properties of xanthan on the autoxidation of soybean oil in cyclodextrin[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry.,1992, 40：945.
       
       [5] Dinis T. C. P., Madeira V. M. C. ，Almeida L. M. Action of phenolic derivatives (Acetaminophen, salicylate, and 5-aminosalicylate) as inhibitors of membrance lipid peroxidation and as peroxyl radical scavengers[J].Archives of Biochemistry and Biophysics.1994, 1：161.
       
       [6] 范元鹄.川芎、细辛、白术及杏仁萃取物之美白与抗老化效果与含此等萃取物之化妆品的有效性[D]. 国立台湾海洋大学，2006.
       
       [7] 郭香吟. 中药复方萃取物之抗老化与美白有效性评估[D]. 国立台湾海洋大学，2003.
       
       [8] 邱 凌, 钟 雪, 庄江兴, 等. 芦荟皮酪氨酸酶抑制剂有效成分的提取与分析[J].厦门大学学报(自然科学版),2008, 47(2):227.
       
       [9] 刘 铮, 肖 艳, 邓 燕. 中药对黑素细胞及酪氨酸酶双向调节作用的研究进展[J].新中医,2008, 40(4):117.