文章标题 全文   多个检索词，请用空格间隔。

       【摘要】 
       目的研究壁虎醇提物对人食管鳞癌细胞株EC9706的生长抑制作用及其机制。方法通过MTT法检测不同浓度、不同时间壁虎醇提物对人食管鳞癌细胞的生长抑制作用;倒置显微镜观察不同浓度壁虎醇提物作用细胞24 h后细胞形态的改变;吉姆萨染色后光学显微镜下观察细胞凋亡的形态改变; SP免疫组化法检测细胞内凋亡蛋白Bax和Bcl-2的表达。结果6～8 mg/ml壁虎醇提物作用于细胞24，48，72 h后能够明显抑制EC9706食管鳞癌细胞株的生长(P<0.01,与阴性对照比较)，抑制率分别为13%～76%, 37%～88%, 54%～93%,抑制作用呈剂量和时间依赖性;Geimsa染色可见凋亡细胞;免疫组化结果显示,壁虎醇提物(6,7 mg/ml)处理细胞24 h后，与阴性对照组比较，细胞内Bcl-2蛋白无明显变化，而Bax蛋白表达升高，Bax/Bcl-2比值升高。结论壁虎醇提物能够抑制EC9706细胞的增殖并诱导其凋亡，其作用机制可能与凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2比值升高有关。
       【关键词】  中药壁虎; 醇提物; 食管癌细胞; 凋亡蛋白
       壁虎又名蝎虎、天龙、守宫，是我国传统的治疗肿瘤的中药材，《四川中药志》关于壁虎的功效有“驱风，破血积包快，治肿瘤”的记录，大量临床和基础研究显示壁虎确有抗肿瘤作用[1,2]。我们前期工作研究表明干壁虎粉可以抑制食管癌细胞的生长增殖，抑制小鼠S180肉瘤的增殖，初步探讨其抗肿瘤作用机制可能与诱导肿瘤细胞凋亡，下调VEGF、bFGF蛋白表达有关[3～5]。本实验研究了干壁虎的醇提物对人食管鳞癌EC9706细胞的增殖和凋亡蛋白Bcl-2、Bax表达的影响，为中药壁虎抗肿瘤作用提供实验依据。
       1 器材
       1.1 药品中药壁虎(安徽省亳州市永刚饮片有限公司)，批号：090301。
       1.2 细胞EC9706食管癌细胞株，由郑州大学医学院王立东教授实验室惠赠。
       1.3 试剂丝裂霉素C(浙江海正药业股份有限公司，批号：H33020786);胎牛血清(Gibco 公司);胰酶(Sigma公司);RPMI-1640干粉(Gibco公司);MTT粉剂(Sigma公司);二甲基亚砜(天津市化学制剂厂);鼠抗人Bcl-2单克隆抗体、鼠抗人Bax单克隆抗体、S-P免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒(购自福州迈新生物技术公司)。
       1.4 仪器二氧化碳培养箱(日本SANYO公司);倒置显微镜XSZ-D2型(重庆光学仪器厂) ;超净工作台SP-DJ-2B型(浙江省金沄市荣华仪器制造有限公司);ZS-板式酶标仪(中科院生物物理所制造);86-3型超声仪(上海超声波仪器厂);旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器公司);冷冻干燥仪(德国MARTIN CHRIST公司);96、6孔培养板为美国Costar公司产品。
       2 方法
       2.1 药物提取及配制
       2.1.1 壁虎醇提物的提取取干壁虎1 000 g粉碎，加入一定体积预冷的Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)浸泡过夜后超声30 min，超低温离心机离心(8 500 r/min,20 min)，取上清，加入无水乙醇使其终浓度为55%, 4℃放置并搅拌(每30分钟搅拌1次)，4 h后离心(8 500 r/min, 20 min)，取上清，真空旋转蒸发(55℃)回收乙醇，浓缩液冷冻干燥得到壁虎醇提物，-20℃保存待用。以上操作均4℃条件下进行。
       2.1.2 药物配制将壁虎醇提物以RPMI1640完全培养液配置8 mg/ml母液，0.22 μm微孔滤膜过滤,母液稀释得7.5，7，6.5，6，5.5 mg/ml供实验用,以上药物均实验前新鲜配用。
       2.2 MTT法[6]测定药物对肿瘤细胞的增殖抑制作用EC9706细胞株生长于含10%胎牛血清的1640完全培养液中,37℃恒温, 5%CO2 ，95%饱和湿度二氧化碳培养箱中生长。取对数生长期的 EC9706 细胞，用0.25%胰酶消化细胞制成单细胞悬液，调整细胞浓度为2×104/ml接种于96孔培养板，每孔100 μl，实验分3组，即实验组、阴性对照组、阳性对照组，每组设5个复孔并设空白调零孔。将接种EC9706细胞的培养板置于37℃,5% CO2,95% 湿度的培养箱中培养24 h，待细胞贴壁后，弃去原有的培养液,实验组分别加入各200 μl的6种不同浓度壁虎醇提物,阴性对照组加200 μl培养液,阳性对照孔组加终浓度为20 μg/ml丝裂霉素C 200 μl,混匀后置于培养箱中分别培养24,48,72 h后取出培养板，每孔加入20 μl浓度为5 mg/ml的 MTT,继续培养4 h终止培养, 吸去孔内上清液，每孔加入二甲基亚砜150 μl,置 37℃摇床中10 min ,使结晶物充分溶解后在酶联检测仪于490 nm波长处测定各孔光密度值(OD值),并按下式计算抑制食管癌细胞的百分率。
       抑制率(%) =[(阴性对照组平均OD值 - 实验组平均OD值) / 阴性对照组平均OD值] ×100%
       2.3 细胞形态学观察96孔板细胞接种方法同MTT法，分别加入5.5，6，6.5，7，7.5，8 mg/ml浓度壁虎醇提物作用24 h后，取出96孔板在倒置显微镜观察每孔细胞形态改变，拍照。细胞爬片后，按常规方法用吉姆萨染色，于光学显微镜镜下观察细胞凋亡形态学改变。
       2.4 S-P法检测Bcl-2、Bax蛋白表达水平取对数生长期的细胞，用0.25%胰酶消化制成单细胞悬液后，以1×105个/ml的细胞浓度接种于内含有盖玻片的6孔培养板中，24 h细胞贴壁后换用新鲜培养液，实验设对照组和药物组，实验组加入6，7 mg/ml壁虎醇提物2 ml，阳性组加入2 ml丝裂霉素C,使其终浓度为20 μg/ml,阴性对照组加入同体积的RPMI 1640培养液，24 h后取出6孔板，细胞爬片用PBS浸洗，4%多聚甲醛室温固定30 min，PBS浸洗;0.3% Trixon-100通透液通透30 min,PBS浸洗;每张爬片滴加1滴3%过氧化氢，孵育10 min，以阻断内源性过氧化酶的活性，PBS浸洗;每张爬片滴加1滴封闭用非免疫性动物血清，室温下孵育10 min，吸去多余液体;每张爬片滴加1滴鼠抗人Bcl-2一抗，37℃孵育1 h，PBS浸洗;每张爬片滴加1滴生物素标记的二抗，37℃孵育10 min. PBS浸洗;每爬切片滴加1滴链亲和素一过氧化物酶溶液，37℃孵育10 min，PBS浸洗;每张爬片滴加100 μl新鲜配制的DAB溶液，显微镜下掌握显色程度，自来水冲洗终止显色，苏木素复染，盐酸酒精分化，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。用同样方法检测Bax蛋白表达。
       以PBS代替一抗作为阴性对照，同时设立阳性对照。Bcl-2阳性表达在胞浆或胞膜，Bax阳性表达在胞浆。每张爬片随机选取6个不同部位，显微镜下拍照，应用成都泰盟BI-2000生物医学图像分析系统对免疫组化阳性细胞进行分析，测定阳性细胞的平均光密度值。
       2.5 统计学处理所有数据用SPSS10.0统计分析软件进行单因素方差分析，计量资料结果以±s表示,P<0.05表示差异有显著性。
       3 结果
       3.1 MTT法检测结果5.5，6，6.5，7，7.5，8 mg/ml壁虎醇提物作用24h对EC9706细胞的抑制率分别为8%，13%，23%，40%，68%，76%;作用48h后对EC9706细胞的抑瘤率分别为28%，37%，56%，77%，86%，88%;继续作用至72 h后，壁虎醇提物对肿瘤生长的抑制作用更为明显，与阴性对照组比较，壁虎醇提物能够显著抑制了EC9706细胞的生长(P<0.01)，其抑制作用随时间、浓度的增加而不断加强，呈一定剂量依赖性和时间依赖性(见表1，图1～2)。24，48，72 h壁虎醇提物的IC50值分别为7.14，6.20，5.80 mg/ml。表1 不同浓度壁虎醇提物对EC9706食管癌细胞的增殖抑制作用
       3.2 细胞形态学观察5.5～8 mg/ml壁虎醇提物处理细胞24 h后，倒置显微镜下观察，阴性对照组细胞大小均一呈上皮型贴壁生长，相互连接成片，细胞多呈梭形，形状规则，生长旺盛。壁虎醇提物组细胞胞浆发生空泡变性，细胞数量明显减少 ,贴壁细胞变小、变圆并浮起，形态完整性受破坏 ,形成大量细胞碎片,上述细胞改变随药物浓度增加，表现越明显。Geimsa染色显示,阴性对照组细胞胞浆染色较浅呈淡蓝色，胞核染成紫红色，细胞胞浆少，核浆比例大，核膜表面光滑，形态大小均一，核仁清晰可见;7 mg/ml壁虎醇提物处理细胞24 h后，部分细胞呈凋亡形态改变，细胞体积缩小，核膜表面不光滑、皱缩，形态不规则;染色质固缩，核深染。
       3.3 免疫组化检测凋亡蛋白的表达免疫组化结果显示，与正常对照组相比，壁虎醇提物和丝裂霉素C处理EC9706细胞24 h后，Bax蛋白表达显著增加(P<0.01), 而Bcl-2的表达无统计学意义(P>0.05)，Bax/Bcl-2的比值增加。结果见表2，图3～4。表2 壁虎醇提物对EC9706细胞Bax、Bcl-2蛋白表达的影响
       4 讨论
       壁虎虽未被载入《中国药典》，但大量的临床报道证明，壁虎对消化道肿瘤治疗有独特的疗效，且毒副作用小[1]。尽管壁虎抗肿瘤作用明确，但其成分十分复杂、作用机制不清楚、临床适应证不明确。目前对壁虎抗肿瘤的活性成分研究较少，本课题研究了壁虎醇提物对人食管鳞癌细胞EC9706增殖抑制作用，结果表明壁虎醇提取物在5.5～8 mg/ml剂量下体外以剂量和时间依赖性的方式抑制人食管癌细胞株EC9706增殖。光镜下可见细胞随着药物浓度增加，细胞数目逐渐减少，细胞体积逐渐变小变圆，直至细胞碎裂。Giemsa染色可见凋亡细胞体积缩小，细胞核表面不光滑、皱缩，形态不规则，核染色质固缩，核深染。
       细胞凋亡是一种非常复杂的生理和病理过程，是受控于基因指导的主动性细胞自我消亡过程，是细胞固有的功能。其形态特征包括细胞固缩、染色质聚集、边集至核膜下及凋亡小体形成[7]。现在普遍认为，无论药物的靶点何在，多种化疗药物最终主要通过诱导肿瘤细胞凋亡或坏死而达到治疗目[8]。凋亡的线粒体通路主要由Bcl-2家族成员所调控，该家族可分为两个亚群：一个亚群Bcl-2，Bid，Bcl-X，Bcl-W等抗凋亡蛋白组成;另一个亚群由Bax，Bak，Bik，Bcl-xs等促凋亡分子组成[9]。下调 Bcl-2或上调 Bax可促进多种因素诱导的多种肿瘤细胞凋亡 ,反之则抑制肿瘤细胞凋亡[10]，Bcl-2蛋白与 Bax蛋白的比值直接影响着细胞受到刺激后发生凋亡的比率，两者的平衡是决定细胞死亡和存活的重要因素。因此，Bax，Bcl-2蛋白表达比例具有重要的生理意义。本研究结果表明壁虎醇提取物能够诱导人食管癌细胞株EC9706凋亡，增强Bax的蛋白表达、通过升高Bax/Bcl-2比值而实现对EC9706细胞增殖和凋亡的调节。
       综上所述，壁虎醇提取物对人食管癌EC9706细胞株增殖有抑制作用，药物作用效果具有较明显的时-效和量-效关系，其抑制作用可能通过上调Bax的表达，通过改变Bax/Bcl-2的比值而诱导细胞凋亡。本实验中所用的醇提取物乃是一种混合物，其抑制肿瘤作用主要由一种成分起作用还是由多种成分协同起作用，有待进一步研究。
       【参考文献】
         　[1] 杨金霞, 王学美. 壁虎治疗肿瘤的研究进展[J].世界华人消化杂志, 2006,14(4):2428.
       
       [2] 张飞春, 李中信, 杜文平.守宫抗肿瘤研究进展[J].河北中医,2009，31(1)：144.
       
       [3] Fei Liu,Jian-Gang Wang,Shu-Ying Wang.Antitumor effect and mechanism of Gecko on human esophageal carcinoma cell lines in vitro and xenografted sarcoma 180 in Kunming mice[J].World Journal of Gastroenterology, 2008,14(25):3990.
       
       [4] 刘 菲,王建刚,席守民,等.中药壁虎抗肿瘤作用的实验研究[J].时珍国医国药，2008,19(4):957.
       
       [5] 刘 菲, 王淑英, 李 艳,等.干壁虎对食管癌细胞和S180荷瘤小鼠的抑制作用[J].中药材,2008，31(9):1304.
       
       [6] 司徒镇强, 吴军正, 刘 斌, 等.细胞培养[M].西安：世界图书出版公司,2007:200.
       
       [7] Tamm I，Sehriever F，Dorken B.Apoptosis：implications of basic research for clinical ontology[J].Lancet Oncol,2001,2(1)：33.
       
       [8] Svkiotis GP，Papavassiliou AG. Apoptosis：the suicide solution in cancer treatment and chemoprevention[J].Expert Opin Investig Drugs,2006,15(6)：575.
       
       [9] Cory S, Adams JM.Killing cancer cells by flipping the Bcl-2/Bax switch[J].Cancer Cell，2005，8(1)：5.
       
       [10] Hengartner M O. The biochemistry of apoptosis[J].Nature,2000,407(6805) : 770.