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       【摘要】 
       目的探讨谷精草总黄酮的提取、鉴别及对羟自由基的清除作用。方法利用超声波乙醇浸提法提取谷精草中的黄酮类化合物，采用化学方法对提取物进行定性鉴别，通过分光光度法测定总黄酮含量，并且考察黄酮提取液对羟自由基的清除作用。结果谷精草中总黄酮含量为5.09%，回收率为102.1%。结论该方法简单可靠，能够有效提取谷精草黄酮，而且黄酮提取液对羟自由基有一定的清除作用。该实验结果为进一步开发和利用谷精草提供了理论依据。
       【关键词】  谷精草; 总黄酮; 清除羟自由基
       Study on Extraction of Total Flavonoids from Eriocaulon buergerianum Koern. and the Scavenging Activity on Hydroxyl Free Radical
       YUAN Jianmei, SHANG Xuefang, WANG Yingling*, XI Rongying, ZHAO Xiaoxia
       (Department Chemistry, Xinxiang Medical University, Xinxiang,Henan 453003, China)
       Abstract：ObjectiveTo study the extraction and identification of total flavonoids from Eriocaulon buergerianum Koern and its Scavenging activity on hydroxyl free radical. MethodsThe total flavonoids from Eriocaulon buergerianum Koern was extracted with ethanol as the solvent by ultrasonic. The quality of extracted flavonoids was identified by chemical methods,and the content of total flavonoids was determined with spectrophotometry. In addition, the effect of extracted flavonoids on hydroxyl free radical was investigated. ResultsThe content of total flavonoids from Eriocaulon buergerianum Koern was 5.09% and the recovery rate was 102.1%. ConclusionIt is an ideal way to extract flavonoids from Eriocaulon buergerianum Koern. The extracted flavonoids show strong scavenging activity on hydroxyl free radical. The results provide a theoretical basis for further development and use of Eriocaulon buergerianum Koern.
       Key words： Eriocaulon buergerianum Koern; Total flavonoids; Scavenging hydroxyl free radical
       谷精草来源于谷精草科(Eriocaulaceae)植物谷精草Eriocaulon buergerianum Koern.的干燥带花茎的头状花序[1]，别名戴星草、珍珠草，生长于水稻田或池沼边潮湿处，主产于江苏、浙江、湖北，是一种药食同源植物，味辛、甘，性平，具有祛风散热、明目退翳的功效[2]。临床上常用于治疗眼结膜炎、结膜云翳、夜盲症、慢性鼻窦炎等疾病。
       谷精草中含有黄酮类化合物，大量研究显示[3，4]，黄酮类化合物具有抗菌、消炎、降血糖、降血压、提高免疫力、抗衰老、抗癌等作用，还可以消除人体内活性氧自由基。自由基具有强氧化性，在正常情况下，人体内的自由基处于不断产生与清除的动态平衡，确保机体正常的生命活动，当体内自由基过量产生或人体自身清除自由基能力下降，自由基可损害机体的组织和细胞，会导致多种疾病的产生与恶化[5，6]。因此，对于黄酮类化合物的研究引起广泛关注，但对于谷精草黄酮的提取及谷精草黄酮对自由基的清除作用尚少有报道。
       利用超声波提取植物中的有效成分可以缩短提取时间，减少溶剂用量，提高提取率[7，8]，为此，本文采用超声波提取谷精草黄酮，对谷精草黄酮提取液进行定性鉴别，同时还考察了黄酮提取液对羟自由基的清除作用。
       1 仪器与材料
       1.1 仪器752型紫外可见分光光度计(上海菁华科技仪器有限公司);SK3310HP 超声波清洗器：(上海科导超声仪器有限公司);SBH- II循环水式真空泵(郑州长城科工贸有限公司);BS244 电子分析天平(德国Sartourus公司);R206D旋转蒸发器(上海申生科技有限公司);WD-9403D紫外分析仪(北京六一仪器厂);索氏提取器。
       1.2 材料谷精草(购买于河南省新乡市张仲景大药房);芦丁对照品(中国药品生物制品检定所);石油醚(沸程60～90 ℃)、无水乙醇、氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝、浓盐酸、三氯化铁、三氯化铝、镁粉、苯、醋酸乙酯、冰醋酸、双氧水、硫酸亚铁、水杨酸均为分析纯。
       2 方法与结果
       2.1 总黄酮的提取称取谷精草，烘干，粉碎，将粉碎后的谷精草粉末包好置于索氏提取器内，用石油醚加热回流提取脱脂6 h，此时抽提液呈无色，脱脂后粉末质量为原粉末的95.62 %。精密称取脱脂后的谷精草粉末3.000 0 g，加75 ml 60 %乙醇，在70 ℃超声波提取60 min，提取4次，抽滤，合并4次滤液，减压回收乙醇至滤液仅剩25 ml左右，放置于100 ml容量瓶中，用60 %乙醇稀释至刻度，制得谷精草提取液。
       2.2 谷精草总黄酮含量测定
       2.2.1 测定方法依据以芦丁为对照品测定谷精草中总黄酮的含量，黄酮化合物与Al3+在碱性条件下形成络合物，此络合物在可见区有稳定的特征吸收峰。
       2.2.2 对照品溶液制备准确称取120 ℃干燥且恒重的芦丁标准品0.020 0 g，以60 %乙醇温热溶解，放冷，用60 %乙醇定容至 100 ml容量瓶中，制成0.200 0 mg/ml储备液用。
       2.2.3 测定波长的选择分别取芦丁储备液、提取液适量，按“2.2.4”项下方法操作，在400～700 nm范围内分别测定其吸光度，结果表明芦丁、提取液中的黄酮化合物与Al3+ 形成的络合物，均在510 nm处有最大吸收，所以选择510 nm作为测定波长。
       2.2.4 标准曲线的制备精密移取芦丁储备液0.00，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00 ml于10 ml容量瓶中，分别加入60 %乙醇使成5 ml，加入5 % NaNO2 0.3 ml，摇匀，放置6 min，加入10 % Al(NO3)3 0.3 ml，摇匀，放置6 min，加入4% NaOH 4 ml，分别用60 %乙醇稀释至刻度，摇匀，放置15 min，以试剂空白为参比溶液，在510 nm处测其吸光度。吸光度测定结果见表1。表1 芦丁对照液吸光度值
       2.2.5 样品总黄酮含量测定精密吸取1.00 ml提取液于25 ml容量瓶中，按“2.2.4”项下方法测定A=0.494，根据回归方程求得提取液C=1.595 8 mg/ml，谷精草中黄酮含量为5.09 %。
       2.2.6 回收率实验精密移取9份提取液各0.50 ml，分3组，分别精密加入0.200 0 mg/ml芦丁对照液0.50，1.00，1.50 ml，按“2.2.4”项下方法测定各溶液A，计算回收率(见表2)。由表2可见，黄酮平均回收率为102.1%，说明此测定方法可行。
       2.3 谷精草黄酮的定性鉴别
       2.3.1 颜色反应盐酸-镁粉反应：取乙醇提取液1 ml于试管中，加入少许镁粉，加入5 滴浓盐酸(一次加入)，观察到泡沫处呈橙红色。
       三氯化铝反应：取乙醇提取液点在滤纸上，滴加1 %三氯化铝乙醇溶液，吹干。在可见光下呈浅黄色 ,在紫外光下可观察到浅蓝色荧光斑点。
       三氯化铁反应：取乙醇提取液1 ml于试管中，滴加5滴1 %三氯化铁溶液，呈墨绿色。
       2.3.2 薄层层析将提取液在硅胶G薄层板上点样，以苯-乙酸乙酯-冰醋酸(95∶5∶4滴)为展开剂，展开，在紫外灯下可观察到蓝绿色荧光斑点。　表2 回收率实验结果
       2.4 谷精草黄酮提取液对羟自由基的清除作用 参照Fenton反应的方法建立·OH自由基产生体系模型[9]，利用H2O2与Fe2+混合后产生·OH，在反应体系中加入水杨酸，·OH氧化水杨酸生成有色物质，其反应如下：H2O2 + Fe2+→·OH +OH-+ Fe3+2·OH+COOHOHCOOHOHOH+H2O 该有色物质在510 nm处有强吸收，若加入能够清除·OH的被测物，便会与水杨酸竞争·OH，使有色物质的生成量减少，所以可以通过测定该有色物质的量确定被测物对·OH的清除率。该反应体系中含有8.8 mmol/L H2O2 2 ml，9 mmol/L FeSO4 2 ml，9 mmol/L水杨酸-乙醇2 ml以及不同浓度的谷精草提取液2 ml。最后加H2O2启动反应，在37 ℃水浴中加热1 h，以蒸馏水为参比，在510 nm处测其吸光度，按照下式计算清除率：
       清除率(%)=[A对照-(A样品-A0)/A对照]×100%
       式中：A对照为没加样品的吸光度;A样品为加样品的吸光度;A0为没加水杨酸的吸光度。
       分别以0.16，0.32，0.48，0.64，0.80 mg/ml的谷精草提取液进行清除羟自由基活性的研究，结果如图1所示。从图1中可以看出，谷精草提取液对·OH有一定的清除作用，清除率随着提取液浓度的增加而增加。
       图1 不同浓度提取液对·OH的清除活性
       3 结论
       采用超声波乙醇浸提法提取谷精草中的黄酮，该提取方法简单易操作，谷精草提取液经定性鉴别含有黄酮类化合物，并且采用分光光度法测定其含量发现谷精草黄酮含量比较高，采用该测定方法回收率为102.1%，说明该测定方法可行。
       谷精草中含有丰富的黄酮，其黄酮具有清除羟自由基的抗氧化作用，且随黄酮浓度的增加，清除作用增强，因此，文本的研究为更好地开发利用谷精草中黄酮类化合提供了科学的依据和参考。
       【参考文献】
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