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       【摘要】 
       目的研究超微归脾丸的抗衰老作用及其机制。方法背部皮下注射D-半乳糖造衰老小鼠模型，造模同时连续灌胃给药45 d后，测定肝脏及脑组织的抗氧化指标(MDA，SOD，GSH-Px)，和胸腺、肝脾的脏器指数，并与普通归脾丸进行比较。结果超微归脾丸可显著提高衰老模型小鼠的胸腺、脾、肝的脏器指数;肝组织中MDA不同程度下降，SOD及GSH-Px活力不同程度提高，与普通归脾丸相比，差异具有显著性意义(P<0.05或P<0.01)。结论超微归脾丸的抗衰老作用优于普通归脾丸，其机制可能与提高免疫功能，清除氧自由基及抗脂质过氧化有关。
       【关键词】  超微归脾丸; 抗衰老; 清除氧自由基; 抗脂质过氧化
       衰老是一种自然的生物现象，主要表现为生物体全身各组织、器官的退行性变化，是诸多病理、生理过程综合作用的结果[1]。随着中国社会老龄化趋势的增强，抗衰老研究已成为热点，中医药以其独特的疗效，在抗衰老抗氧化的研究中占有日益重要的地位。归脾丸由黄芪、当归、白术、茯苓、酸枣仁等十多味中药配制而成，具有健脾益气、补血养心的功效，适用于食少体倦、健忘失眠、心悸及各种出血症，近年来的临床应用表明，该药还有一定的抗衰老、升白细胞等作用。本研究用皮下注射D-半乳糖造亚急性衰老小鼠模型，以小鼠的胸腺及肝脾脏器指数、肝及脑组织的抗氧化指标(MDA，SOD，GSH-Px)作为观察指标，对所制超微归脾丸的抗衰老作用及其机制进行了研究，并与普通归脾丸进行了比较，为超微归脾丸用于临床提供实验依据。现报道如下。
       1 材料
       1.1 动物健康小鼠60只，体质量18～20 g，由湖南中医药大学实验动物中心提供(合格证号：001978)。
       1.2 试剂与仪器普通归脾丸、超微归脾丸(实验室自制)。丙二醛(MDA)测定试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)测试盒、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)测试盒(南京建成生物工程研究所，100t 批号20090107);无水乙醇(AR级);冰醋酸(长沙安泰精细化工实业有限公司，批号20031424)。XHF-D内切式匀浆机(宁波新芝生物科技股份有限公司);UV-可见分光光度计(北京瑞利分析仪器公司，批号011224);50 μl，100 μl，1 000 μl移液枪(上海安亭微量进样器厂)。
       2 方法
       2.1 普通归脾丸的制备称取10倍处方量各药材饮片，加10倍量水浸泡30 min，加热回流煎煮1.5 h，离心过滤，滤渣加10倍量的水加热回流煎煮1.0 h，离心过滤，合并滤液，浓缩成浓缩液，浓缩液置蒸发皿中蒸干，置真空烘箱内60℃真空干燥，得干浸膏。干浸膏粉碎成100目浸膏粉，泛制成丸，干燥得普通归脾丸。
       2.2 超微归脾丸的制备称取10倍处方量(除木香、白术、茯苓)各药材超微饮片，加10倍量的水，浸泡30 min，75℃下进行动态提取1.5 h，离心过滤，滤渣加8倍量的水，再提取1.0 h，离心过滤，合并滤液，浓缩成浓缩液，浓缩液置蒸发皿中蒸干，置真空烘箱内60℃真空干燥，得干浸膏;木香、白术经CO2超临界流体萃取得挥发油，挥发油用β-环糊精包合，得挥发油β-环糊精包合物，药渣与处方其它药物合并提取;干浸膏粉碎成100目浸膏粉，再与茯苓超微粉、挥发油包合物混匀泛制成丸，干燥得超微归脾丸。
       2.3 动物分组取小鼠60只, 购于湖南中医药大学实验动物中心，体重18～20 kg，雌雄各半，用随机排列表法分为6组，分别为空白对照组，模型组，超微归脾丸低剂量、中剂量、高剂量组及普通归脾丸剂组(中剂量)。除了空白对照组外，其余5组均参照文献制备亚急性衰老小鼠模型[2]。
       2.4 模型制备[2]模型组及给药组小鼠每只小鼠皮下注射300 mg·kg-1·d-1的3%D-半乳糖生理盐水溶液，1次/d，连续45 d。
       2.5 给药方法将普通归脾丸、超微归脾丸均用蒸馏水溶解，配成相当于生药材1.0 g/ml的药液，超微归脾丸低、中、高剂量组均灌服超微归脾丸药液，普通归脾丸组灌服普通归脾丸药液。根据日服用剂量，按人体模型表面积换算后给药剂量分别为：超微归脾丸高剂量组15.50 g/ ( kg·d)、中剂量组8.00 g/ ( kg·d)、低剂量组3.89 g/ ( kg·d)，普通归脾丸组按超微归脾丸中剂量组给药，模型组、空白对照组给予中剂量同体积生理盐水。
       2.6 指标测定连续给药45 d后，颈椎脱臼处死小鼠。取胸腺、脾、肝称重测定脏器指数;同时将肝及脑制成1%组织匀浆(组织匀浆的制备按试剂盒说明)，按试剂盒中方法测定肝及脑组织SOD的活力、MDA的含量、GSH-Px活性。
       2.7 统计学分析数据均采用SPSS12.0软件完成统计处理。结果以±s表示;计量资料组间差异比较采用t检验。
       3 结果
       3.1 各归脾丸对小鼠胸腺、脾、肝脏指数的影响实验结果见表1。由表1可知，与模型组比较，各归脾丸组均能显著提高亚急性衰老小鼠模型的鼠的脏器指数(P<0.05，P<0.01)，超微归脾丸低、中剂量组与普通归脾丸组相比，差异无统计学意义，超微归脾丸高剂量组与普通归脾丸组相比差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。从胸腺、脾脏器指数的比较可知，普通归脾丸组与超微归脾丸各剂量之间无明显区别，同时超微归脾丸各剂量之间也无显著性差异。表1 各归脾丸对小鼠胸腺、脾脏、肝脏的影响与模型组比较，●P<0.01，▲P<0.05; 与普通归脾丸组比较，◆P<0.01，■P<0.05;n=5
       3.2 各组小鼠肝脏MDA含量、SOD和GSH-Px活性测定结果见表2，与模型组比较，普通归脾丸组、超微归脾丸低、中、高剂量组的肝MDA含量、SOD和GSH-Px活性都具有显著性差异(P<0.05)。与普通归脾丸组相比较，超微归脾丸低、中、高剂量组的肝MDA含量和SOD都有显著性差异(P<0.01);与普通归脾丸组相比较，超微归脾丸中、高剂量组的GSH-Px活性明显升高(P<0.01)，但超微归脾丸低剂量组却无显著性差异。表2 不同组别小鼠肝组织中MDA含量、SOD和GPX活性检测结果与模型组比较，●P<0.01，▲P<0.05; 与普通归脾丸组比较，◆P<0.01，■P<0.05;n=5
       3.3 各组小鼠脑MDA含量、SOD和GSH-Px活性测定结果见表3。与模型组比较，普通归脾丸组、超微归脾丸低、中、高剂量组的脑MDA含量、SOD和GSH-Px活性都有显著性差异(P<0.05，P<0.01)。与普通归脾丸组比较，超微归脾丸低、中、高剂量组的脑MDA含量、SOD和GSH-Px活性均无明显区别。表3 不同组别小鼠脑组织中MDA含量、SOD和GPX活性检测结果　与模型组比较，●P<0.01，▲P<0.05; 与普通归脾丸组比较，◆P<0.01，■P<0.05;n=5
       4 讨论
       本实验通过小鼠颈背部皮下注射300 mg/(kg·d)的3%D-半乳糖生理盐水溶液，连续注射45 d造亚急性小鼠衰老模型。由实验结果可知：模型组小鼠肝、脑的各抗氧化指标明显高于或低于空白对照组，重要的组织器官胸腺、脾以及肝脏显著性萎缩，说明本实验造模成功。
       MDA是一种脂质过氧化产物，能引起细胞代谢及功能障碍，因而引起细胞损伤，进而加速机体衰老[3，4];SOD活力的高低间接反应了机体清除氧自由基的能力[5];GSH-Px是机体内广泛存在的一种重要的催化过氧化氢酶[6]，测定GSH-Px可以间接的反应细胞的完整程度。饲养动物45 d后，给予归脾丸的各组小鼠的抗氧化指标如肝、脑的MDA含量、SOD和GSH-Px活性均有明显改善，其中超微归脾丸对D-半乳糖所致亚急性衰老小鼠肝的作用明显优于普通归脾丸，提示归脾丸具有直接或间接的降低机体内脂质氧化程度，增强机体清除自由基的能力，保护细胞的结构和功能的作用，从而达到改善机体物质代谢絮乱及延缓机体衰老的功效。但此作用对脑的影响较弱，可能是由于归脾丸是口服给药，有效成分难以透过血脑屏障而发挥作用。
       超微粉碎技术是近年来中药制剂领域引进的现代高科技与传统制剂相结合的先进技术，它可以使原生药材达到细胞级和部分纳米级粉碎，从而可增加药物的溶出度和吸收率，提高生物利用度，减小用量，增强疗效。
       本实验研究结果显示，用超微粉碎技术对归脾丸的原药材进行加工处理后制得的超微归脾丸对D-半乳糖亚急性衰老小鼠的抗衰老作用优于普通归脾丸，但其临床疗效是否增强还需通过进一步的实验研究进行验证。
       【参考文献】
         　[1] 陈志蓉.抗衰老药物的研究进展[J].海峡药学，2008，20(1)：8.
       
       [2] 朱亚珍，朱虹光.D-半乳糖致衰老动物模型的建立及其检测方法 [J].复旦学报(医学版)，2007，34(4)：617.
       
       [3] 樊莲莲，刘金荣，苏文成，等. 西伯利亚白刺果油对衰老模型小鼠抗氧化性作用的研究[J].石河子大学学报， 2007，25(2)：207.
       
       [4] LIU Kun-zhi.The effect of deoxyribonucleic acid on the activity of superoxide dismutase and peroxidoseE[J].Acta Laser Biology Sinica，2002，11(2)：119.
       
       [5] Liu JH.Ho SC.Lai TH，et a1.Protective effects of Chinese herbs on D-galaetose-induced oxidative damage[J].Method Find Exp Clin，2003，25(6)：447.
       
       [6] 马 森.谷胱甘肽过氧化物酶和谷胱甘肽转硫酶研究进展[J].动物医学进展，2008，29(10)：53.