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       【摘要】 
       目的探讨鹿衔草黄酮苷对大鼠离体胸主动脉的作用及其可能的作用机制。方法采用离体血管实验方法，经生物信号采集与分析系统测定血管环张力的变化;激光扫描共聚焦显微镜技术检测血管平滑肌细胞内钙浓度。结果鹿衔草黄酮苷(20 mg·L-1)能够浓度依赖性的降低大鼠离体胸主动脉血管环张力。分别能减小苯肾上腺素(PE) (10-6 mmol·L-1)和KCl(60 mmol/L)对血管环的收缩幅度，最大舒张幅度分别为(102.7±1.6)%(P﹤0.01)和(39.6±1.6)%(P﹤0.01)。此舒张作用不能被一氧化氮合酶抑制剂左旋硝基精氨酸甲酯(L-NAME 300 mmol·L-1)、鸟苷酸环化酶抑制剂亚甲蓝(MB 10-5mmol·L-1)、环氧酶抑制剂吲哚美辛(Indo 10-5mmol·L-1 )、ATP依赖性钾通道阻断剂格列苯脲(Gli 10-6 mmol·L-1 )、Ca2+依赖性钾通道阻断剂四乙基铵(TEA 10-6 mmol·L-1)所阻断。但可以被瞬时外向钾电流阻断剂氯化钡(BaCl2 10-6 mmol·L-1 )和钾通道阻断剂4-氨基吡啶(4-AP 1 mmol·L-1)阻断。在无钙灌流液中，用HPFG(2 mg·ml-1)孵育10 min可使CaCl2的量效曲线下移且使PE的最大收缩幅度降低(P﹤0.01)。激光扫描共聚焦检测细胞内钙的结果表明，鹿衔草黄酮苷浓度依赖性(1 ，2 g·L-1)地抑制了静息状态平滑肌细胞胞浆内钙浓度的升高。结论鹿衔草黄酮苷能够浓度依赖性舒张大鼠胸主动脉，其作用机制可能是开放瞬时外向钾通道，抑制细胞内钙离子释放和细胞外钙离子内流，但并不影响一氧化氮的释放和前列环素的生成。
       【关键词】  鹿衔草黄酮苷; 胸主动脉环; 激光扫描共聚焦显微镜
       鹿衔草Herba pyrolae又名鹿蹄草，为鹿蹄草科植物鹿蹄草或普通鹿蹄草的干燥全草，主产于西藏、云南、贵州等地。鹿衔草具有祛风湿、强筋骨、止血的功效，用于风湿痹痛、腰膝无力、月经过多、久咳劳嗽等证。化学研究发现[1]:鹿衔草含有的化学成分主要为黄酮苷类化合物，包括金丝桃苷、槲皮素、2""-o-没食子酰基金丝桃苷等[2]。有药理实验表明：鹿衔草黄酮苷(Herba Pyrolae Flavonoid glycoside,HPFG)对大鼠急性心肌缺血有保护作用，其机制与抗脂质过氧化有关[3]。其有效单体2""-o-没食子酰基金丝桃苷对大鼠实验性心肌缺血再灌注损伤有保护作用[4]，同时对豚鼠右心室缺氧再给氧的心肌电活动也有影响[5]，但HPFG对大鼠离体血管的作用及其相关机制未见报道。因此，本实验采用离体大鼠胸主动脉环张力测定和激光共聚焦细胞内钙检测的方法来观察鹿衔草黄酮苷对大鼠离体胸主动脉血管的作用，并对其作用机制进行了探讨。
       1 材料与仪器
       1.1 药品与试剂鹿衔草，黑龙江省药材批发市场购得,经本校生药学教研室鉴定;L-N-硝基精氨酸甲酯(NG-nitro-L-arginine-methylester, L-NAME)，4-氨基吡啶(4-aminopyrimide, 4-AP)，四乙基铵(tetrathylamonium，TEA),苯肾上腺素(phenylephrine, PE)，卡巴胆碱(Carbacholine, CCH)，格列苯脲(glybenclamide)，亚甲蓝(methylene blue,MB)，吲哚美辛(indomethacine,Indo) 及乙二醇四醋酸(ethylene glycol tetraacetic acid,EGTA)购自Sigma公司， 其它试剂为国产分析纯。
       1.2 动物健康Wistar 雄性大鼠,体质量(250 ±20) g ，由哈尔滨医科大学实验动物中心提供。
       1.3 仪器HV-4血管环灌流系统(成都泰盟科技有限公司);BL-420E生物机能实验系统(成都泰盟科技有限公司);JH-2肌张力换能器(北京航天医学工程研究所);旋转蒸发仪(上海申胜生物技术有限公司);真空干燥箱(上海申胜生物技术有限公司);AL104 型电子天平(上海勒-托利多仪器有限公司);数控恒温浴锅(上海申胜生物技术有限公司)。
       2 方法
       2.1 鹿衔草黄酮苷(Herba Pyrolae Flavonoid glycoside,HPFG)的制备 取鹿衔草生药1 kg，20倍量65%乙醇加热回流提取两次，1 h/次，合并提取液，过滤，回收乙醇至无醇味，得到浸膏，加20%乙醇500 ml稀释并搅拌，得到的溶液经石油醚脱脂后，用等体积醋酸乙酯萃取，弃去萃取液，剩余部分用聚酰胺柱层析，20%～95%乙醇作为洗脱液洗脱，收集75%乙醇洗脱液并用旋转蒸发仪收干，收干物经过真空干燥箱烘干，得到棕黑色粉末，以金丝桃苷为对照品应用紫外分光光度法测定其黄酮平均含量为85.23%。
       2.2 胸主动脉环的制备与稳定[6] 将Wistar大鼠用10%(0.3 ml·100 g)水合氯醛麻醉后，迅速取出胸主动脉，置于预先冷冻(4℃ )的 Krebs-Henseleit(K-H)液(NaCl 118 mmol·L-1 ，KCl 4.7 mmol·L-1 ， CaCl2 2.5 mmol·L-1 ，KH2PO4 1.2 mmol·L-1 ，MgSO4 1.2 mmol·L-1 ，NaHCO3 25.0 mmol·L-1 ，Glucose 11.1 mmol·L-1 ，pH 7.20～7.40 )中，持续通95%O2+5%CO2的混合气体。去除血管壁周围的结缔组织和管腔内的残留血液.将血管剪成3～4 mm 的主动脉环，将主动脉环移至盛有5ml K-H液，恒温37℃ ，持续通混合气体的浴槽中，用两支 L 钩穿过血管环，一端固定在浴槽内的挂钩上，另一端与肌力传感器相连，用BL-420E生物机能系统记录血管环的张力。血管环预先给基础张力0.5 g ，平衡40 min，然后将张力调节至1.5 g，再平衡40 min, 在平衡间不断调整张力，使之维持基础状态，每隔20 min更换营养液1次。以PE或KCl刺激血管环,测试血管活性，达到最大幅度后冲洗至刺激前的状态。
       利用卡巴胆碱检验血管内皮活性。待血管环稳定后，换液1次，浴槽中加入10-6 mmol/L 的PE，收缩达峰值15 min之后，加入4.5 μmol·L-1卡巴胆碱(CCH)检验血管内皮活性，若加入卡巴胆碱后使PE预收缩的血管舒张60%～90%，可认为内皮完整，反之，则可认为内皮破坏。
       以PE(10-6 mmol/L PE)诱发最大收缩幅度为100% ,以加入药物后的血管张力幅度与PE诱发的最大幅度之间的比率反映血管张力的变化。
       2.3 胸主动脉环实验分组及处理为探讨HPGF对离体大鼠胸主动脉环的影响将实验分为以下几组。
       2.3.1 HPFG对PE预收缩离体大鼠胸主动脉环的影响组取内皮完整的血管环，加入10-6 mmol/L PE，达到收缩平台后，采用累积加药法逐步加入HPFG 0.5，1，2，3，4 g/L，观察血管张力的变化，与累积加生理盐水的空白对照组比较。
       2.3.2 HPFG对KCl预收缩离体大鼠胸主动脉环的影响组取内皮完整的血管环，加入60 mmol/L KCl，达到收缩平台后，采用累积加药法逐步加入HPFG0.5，1，2，3，4 g/L，观察血管张力的变化，与累积加生理盐水的空白对照组比较。
       2.3.3 内皮机制对HPFG舒张作用的影响组内皮完整的大鼠主动脉环分别用L-NAME(300 mmol·L-1)、MB 、Indo，孵育10 min后, 加入10-6 mmol/L PE，达到收缩平台后，累积加药法逐步加入HPFG，观察HPFG引起的血管张力变化。
       2.3.4 钾通道阻断剂对HPFG舒张作用的影响组内皮完整血管环，分别用4-AP(1 mmol/L)，TEA(1 mmol/L),glybenclamide(10 μmol/L),BaCl2 (10 μmol/L)孵育10 min后，采用累积加药法逐步加入HPFG，观察血管张力变化。
       2.3.5 HPFG对CaCl2量效曲线的影响组空白组：内皮完整血管环用K-H液稳定后，换用无钙K-H灌流液(含10-4 mol EGTA)孵育30 min后，加KCl孵育10 min，采用累积加药法逐步加入CaCl2 0.5，1，2，4，8 mmol/L,观察血管张力变化。
       给药组：内皮完整血管环用K-H液稳定后，换用无钙K-H灌流液(含10-4 mol EGTA)孵育30 min后，加入2 mg/ml HPFG孵育10 min，加KCl孵育10 min，采用累积加药法逐步加入CaCl2 0.5，1，2，4，8 mmol/L,观察血管张力变化。
       2.3.6 HPFG在无钙灌流液中对PE收缩作用的影响组空白组：内皮完整血管环用K-H液稳定后，换用无钙K-H灌流液(含10-4 molEGTA)孵育30 min，加入PE 10-6 mmol/L，观察血管张力变化。
       给药组：内皮完整血管环用K-H液稳定后，换用无钙K-H灌流液(含10-4 mol EGTA)孵育30 min，加入2 mg/ml HPFG孵育10 min，加入PE 10-6 mmol/L，观察血管张力变化。
       2.4 大鼠胸主动脉平滑肌细胞的急性分离与激光共聚焦细胞内钙检测大鼠胸主动脉平滑肌细胞的急性分离的具体方法见参考文献[5]。 取稳定好的细胞，用20 μmol·L-1的Fluo-3/AM染色，在37℃恒温水浴中孵育45 min，去除负载液后，用正常台氏液再洗涤1次，最后将细胞用正常台氏液稀释到所需浓度待定。染色后的细胞进行药物处理,阳性对照组细胞加入VER 10-5 mol·L-1孵育10 min后加KCl(60 mmol/L), 给药组细胞分别加入HPFG 1 g·L-1，HPFG 2 g·L-1 孵育10 min后加KCl(60 mmol/L)，阴性对照组细胞直接加KCl(60 mmol/L)，(细胞外高K+激活L型钙通道，使Ca2+内流，细胞内Ca2+浓度升高)。用激光扫描共聚焦显微镜实时监测[Ca2+]i的变化,激发波长为488 nm，以Fmax/F0代表相对细胞[Ca2+]i浓度峰值[6]。
       2.5 统计学处理所有数据均以 ±s表示，采用student-t检验和ANOVA做统计学分析，P<0.05认为有统计学差异。
       3 结果
       3.1 HPFG对PE预收缩离体大鼠胸主动脉环的影响在内皮完整的大鼠胸主动脉环上，HPFG(0.5，1，2，3，4 g/L)可使大鼠胸主动脉环呈浓度依赖性舒张。与空白对照组比较，最大舒张幅度为(102.7±1.6)%。见图1。
       3.2 HPFG对KCl预收缩离体大鼠胸主动脉环的影响在内皮完整的大鼠胸主动脉环上，HPFG(0.5，1，2，3，4 g/L)可使大鼠胸主动脉环呈浓度依赖性舒张。与空白对照组比较，最大舒张幅度为(39.6±1.6)%。见图2。
       3.3 内皮机制对HPFG舒张作用的影响将内皮完整的大鼠主动脉环分别用一氧化氮合酶阻断剂(L-NAME 300 mmol·L-1)、鸟甘酸环化酶抑制剂(MB)、前列腺素抑制剂(Indo)，孵育10 min后，加入10-6 mmol/L PE，达到收缩平台后，加入HPFG(0.5，1，2，3，4g/L)，HPFG引起的血管舒张作用，与未加入阻断剂的HPFG给药组相比，无明显变化P>0.05。见图3。
       3.4 钾通道阻断剂对HPFG舒张作用的影响内皮完整血管环用电压敏感型K+通道(Kv)抑制剂4-AP，内向整流钾通道抑制剂(KIR)BaCl2孵育10 min后，HPFG引起的血管舒张幅度明显减弱，(与未加入阻断剂的HPFG给药组相比，P<0.01)。而用ATP敏感K+通道(KATP)抑制剂glybenclamide，Ca2+激活的钾离子通道(Kca)抑制剂TEA，孵育10 min后，HPFG引起的血管舒张幅度与未加入阻断剂孵育的HPFG给药组相比没有差别 (P>0.05)。见图4。
       3.5 HPFG对CaCl2量效曲线的影响在无钙K-H灌流液(含10-4 mol EGTA)中，HPFG 2 g/L孵育10min后，可使CaCl2量效曲线下移 ，与空白对照组相比差异有显著性 (P<0.01)。见图5。
       3.6 HPFG在无钙灌流液中对PE收缩作用的影响在无钙K-H灌流液(含10-4 molEGTA)中，HPFG 2 g/L孵育10 min后，可明显抑制PE引起的血管环收缩作用 ，与空白对照组相比差异有显著性 (P<0.01)。见图6。
       3.7 HPFG对主动脉平滑肌细胞胞浆[Ca2+]i的影响将负载后的细胞置于正常台氏液的浴槽中，在倒置显微镜上用激光扫描，并在二三次扫描之间分别加入HPFG。结果显示：在静息条件下，HPFG可剂量依赖性的抑制有钙台式液中平滑肌细胞内[Ca2+]i的升高，1 g·L-1时升高为verapamil阳性对照组的1.29倍，2 g·L-1时升高为verapamil阳性对照组的1.1倍，与KCl 阴性对照组相比有显著性降低(P<0.05)。见图7。
       4 讨论
       实验结果表明，在离体条件下，HPFG可以舒张由PE或KCl预收缩的内皮完整的血管环，并且，此舒张作用具有浓度依赖性。
       本实验观察到：对于内皮完整的血管环，分别使用一氧化氮合酶阻断剂L-NAME、鸟甘酸环化酶抑制剂MB、环氧酶抑制剂Indo预处理后，HPFG的舒张程度并无明显变化。NO舒张血管的机制是通过激活鸟苷酸环化酶，使cGMP含量升高，细胞内钙水平降低，促使肌球蛋白轻链脱磷酸化，导致平滑肌松弛，血管舒张[7]。而NO是由一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)催化L-精氨酸与氧结合后释放的。在本实验中， L-Name和MB分别从不同途径阻断了这一机制的发挥，而HPFG舒张血管的作用却没有受到影响。前列腺素I2是前体物质在血管内皮上经环氧酶(COX)，前列环素合成酶代谢生成的舒张血管物质。Indo是环氧酶抑制剂，可以抑制前列腺素I2合成，本实验发现Indo并没有阻止HPFG舒张血管的作用。因此，我们可以初步认为HPFG舒张血管作用与血管内皮上的NO机制和前列腺素I2无关。
       K+通道在调节血管平滑肌作用中占有重要地位。激活血管平滑肌上的K+通道，能引起细胞膜超极化，抑制细胞外钙内流，血管舒张。血管平滑肌上主要存在4种K+通道：ATP敏感K+通道(KATP), 内向整流型K+通道(KIR)， Ca2+激活的K+通道(Kca)，电压敏感型K+通道(Kv)。glybenclamide为KATP非特异性抑制剂，BaCl2为KIR抑制剂，TEA和4-AP分别是Kca和Kv抑制剂。本实验显示，分别用BaCl2、和4-AP孵育后，HPFG引起的舒张血管作用明显减弱，这一结果可以提示我们，内向整流型K+通道(KIR)和电压敏感型K+通道(Kv)参与了HPFG的舒张血管作用。
       PE 诱导的血管收缩是由α1肾上腺素受体的激活造成的, 主要是通过激活磷脂酶C, 产生细胞内第二信使甘油二酯(diacylglycero l，DG) 和三磷酸肌醇( 1，4，5-triphosphateinosito l， IP3 ) ,DG 可以激活蛋白激酶C(protein kinase C， PKC)，使VSMC 内钙调蛋白等细肌丝磷酸化、肌球蛋白ATP酶激活、细胞内[Ca2+]i浓度上升,导致肌球蛋白牵动肌动蛋白引起平滑肌的收缩[6] 。而IP3 则可以诱导肌浆网内的钙离子释放。即PE最终是通过胞内肌浆网中Ca2+释放及胞外Ca2+内流而引发血管收缩的。血管平滑肌上存在两种钙通道：一种为电压依赖性钙通道(potential dependent Ca2+ channel，PDC)，另一种为受体操控性钙通道(receptor operated channel，ROC)。激活PDC，引起细胞外钙内流;激活ROC，引起细胞外钙内流和细胞内钙释放，使胞浆内游离Ca2+升高，使血管平滑肌收缩[8]。KCl诱导的血管收缩,其机制主要是使PDC开放，细胞外钙离子内流,从而增加细胞内钙离子的浓度。在本实验中，用HPFG孵育后可以使CaCl2的量效曲线下移并且阻断了PE在无钙液中诱导的血管收缩证实了HPFG可以抑制外钙内流和内钙释放，从而抑制细胞内Ca2+浓度的升高，使血管舒张。另外，我们采用激光扫描共聚焦显微镜检测用HPFG处理的血管平滑肌细胞，发现HPFG能够明显抑制细胞内钙升高，由此证明HPFG的舒张血管作用与抑制细胞内Ca2+浓度升高有关。
       通过本实验，我们证实了鹿衔草黄酮苷浓度依赖性舒张血管的作用，并初步探明此作用与抑制细胞内Ca2+浓度升高有关。希望本实验结果能为鹿衔草的进一步开发提供有益的启示。
       【参考文献】
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