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       【摘要】 
       目的探讨枸杞多糖对甲基苄基亚硝胺诱导食管癌大鼠外周血细胞免疫功能的影响及其意义。方法健康雄性F344大鼠40只，随机分为模型组(10只)、治疗组(10只)、生理盐水对照组(10只)和正常对照组(10只)。正常对照组常规饲养，其余两组以甲基苄基亚硝胺(NMBA)0.5 mg/kg皮下注射于大鼠诱导食管癌模型，治疗组在诱癌同时预防性给予枸杞多糖10 mg/kg灌胃治疗，生理盐水对照组给予生理盐水1ml/kg灌胃。在诱癌9周、15周每组分别取5只大鼠抽取外周血，EDTA抗凝,用流式细胞仪检测大鼠外周血中CD4+T细胞和CD4+CD25+调节性T细胞(Tr细胞)的细胞数，另留取血清ELISA法检测大鼠外周血IL-10的含量。结果甲基苄基亚硝胺诱导大鼠食管癌后大鼠外周血中CD4+T细胞比例显著下降，CD4+CD25+Tr细胞比例显著升高;此过程随诱癌时间而加重，各时间点与对照组比较差异均有显著性(P均<0.05);用药后9周、15周枸杞多糖治疗组CD4+CD25+Tr细胞占淋巴细胞百分比显著低于模型组(P<0.05)，CD4+T细胞比例显著高于模型组(P<0.05);模型组大鼠血清IL-10水平显著高于正常对照组，经枸杞多糖治疗后显著下降。结论甲基苄基亚硝胺诱导大鼠食管癌后外周血中CD4+CD25+Tr细胞表达增强，IL-10分泌显著增加，枸杞多糖可有效抑制其表达，显著改善实验性食管癌大鼠细胞免疫功能障碍。
       【关键词】  甲基苄基亚硝胺; 枸杞多糖; 食管癌; 流式细胞术; T细胞
       我国食管癌的发病率目前居世界第一位，因此研究食管癌发生发展的机制以及寻找治疗食管癌的有效措施是当前急需攻克的重大难题。已有的研究显示肿瘤免疫逃逸是肿瘤发生发展的重要机制，而越来越多的证据表明CD4+CD25+调节性T细胞(Regulatory T cell, Tr)可能在肿瘤免疫逃逸中起了关键作用[1，2]。本课题组在中药枸杞多糖抗肿瘤的研究过程中, 发现枸杞多糖(lycium bararum polysaccharides，LBP)在体外可刺激人外周血DC(树突状细胞)分化成熟、增加DC细胞产生IL-12和TNF-α等免疫功能[3]，而其在体内对肿瘤免疫的作用尚未见报道。因此本研究中我们以甲基苄基亚硝胺(N-nitrosomethylbenzylamine, NMBA)诱导大鼠食管癌实验动物模型为基础，观察了CD4+CD25+调节性T细胞在食管癌形成过程中的变化，并观察了枸杞多糖对其调节作用，从而为枸杞多糖的开发利用提供实验依据。
       1 材料与仪器
       甲基苄基亚硝胺(NMBA)，纯度>98%，购自日本NARD Co.Ltd(Osaka, Japan)公司,使用时用生理盐水配制。枸杞多糖由本校实验中心从宁夏优质枸杞子中分离提取，纯度超过99%，异硫氰酸荧光素(FITC)标记的小鼠抗大鼠CD4单克隆抗体(单抗)，藻红蛋白(PE)标记的小鼠抗大鼠CD25单抗均购自美国BD公司产品。Epics XL型流式细胞仪(美国Coulter公司)。40只健康雄性F344大鼠，5～6周龄，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供[合格证号: SCXX(沪)2007 0005]。
       2 方法
       2.1 食管癌动物模型制备及分组大鼠适应环境2周，被随机分为模型组、治疗组、生理盐水对照组和正常对照组，每组10只。正常对照组大鼠常规饲养，生理盐水对照组给予生理盐水1 ml/kg灌胃，模型组大鼠仅皮下注射0.5 mg/kg NMBA，治疗组大鼠同时给予NMBA0.5mg/kg皮下注射及LBP10 mg/kg灌胃。给药方案：3次/周，共5周。
       2.2 大鼠外周血CD4+及CD4+CD25+T细胞的表达应用荧光直接标记法及流式细胞仪检测外周血CD4+及CD4+CD25+T细胞水平。取不同荧光标记的单克隆抗体各10μl，分别加入100μl EDTA抗凝的全血，室温下孵育15 min，加入红细胞裂解液，PBS洗涤2次，用流式细胞仪检测。测定5 000个细胞，记录CD4+T细胞和CD4+CD25+Tr细胞分别占淋巴细胞的百分比。Cellquest软件分析数据。
       2.3 大鼠外周血IL-10的检测收集各组大鼠外周血，离心取血清，ELISA法检测血清IL-10水平。严格按试剂盒说明书操作。
       2.4 统计学处理所有检测数据以±s表示，多组间比较采用方差分析，两组间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
       3 结果
       3.1 LBP对实验性食管癌大鼠外周血调节性T细胞的影响与正常对照组相比，NMBA诱癌9周时，模型组外周血中CD4+T细胞比例显著降低，CD4+CD25+Tr细胞比例显著升高，此过程随诱癌时间而加重。LBP治疗组诱癌9周、15周外周血中CD4+T细胞比例升高，CD4+CD25+Tr细胞比例降低，与同时期模型组比较均具有统计学意义(P<0.05)。生理盐水对照组各指标在各时间点与正常对照组比较均无统计学意义(P>0.05)。见表1。表1 LBP对NMBA诱导食管癌大鼠CD4+T细胞和CD4+CD25+Tr细胞占淋巴细胞百分比的影响与正常对照组比较，*P<0.05;与模型组比较，P<0.05;与9周比较，aP<0.05;n=5
       3.2 LBP对实验性食管癌大鼠外周血IL-10和IL-2的影响NMBA诱癌组大鼠外周血IL-10含量显著高于正常对照组和生理盐水对照组，但随诱癌时间延长未见显著性变化，经LBP预防性治疗后，IL-10水平显著下降。见表2。表2 LBP对NMBA诱导食管癌大鼠外周血IL-10、IL-2水平的影响与正常对照组比较，*P<0.05; 与模型组比较，#P<0.05
       4 讨论
       肿瘤患者在接受放射线和化疗药物治疗时,射线和药物对机体的免疫系统有抑制作用,致使机体的免疫功能进一步下降,影响了治疗效果并可导致一些不良反应。所以,解决肿瘤患者免疫功能低下问题成为治疗肿瘤非常关键的环节。最近,国内外学者提出生物反应调节(biological responsemodifier,BRM)的概念,强调在肿瘤放化疗及手术治疗的同时应用BRM,不但能提高患者的免疫功能,还可减轻上述治疗对免疫系统及造血系统的损害, 从而提高治疗效果。在我国,中药取自天然,来源广泛、容易获得、不良反应小。因此,从中药中提取有效成分作为BRM显示其明显优势。为此,本实验对LBP免疫调节作用进行了研究,显示了很好的免疫促进作用,为进一步研究作用机制,本实验研究了LBP对实验性食管癌大鼠细胞免疫功能的影响。
       近期研究报道，CD4+CD25+调节性T细胞不仅在保持免疫耐受中起重要作用，而且与肿瘤免疫关系密切。肿瘤患者CD4+CD25+ Tr细胞增加， CD4+CD25+ Tr可以抑制肿瘤特异性的免疫反应，有利于肿瘤的生长和转移，对免疫治疗起负调节作用。Ichihara等[3]研究表明，CD4+CD25+T细胞在胃癌和食管癌患者外周血及粘膜中显著增多，并且能够分泌大量抑制性的细胞因子，抑制正常细胞的增殖。Shimizu等[4]去除CD4+CD25+T细胞可诱导同源肿瘤细胞的免疫应答，也可以促进肿瘤病变部位的前炎症反应，从而利于诱导对多种肿瘤抗原的免疫应答，证明了CD4+CD25+T细胞可以抑制体内抗肿瘤反应。本研究结果显示，NMBA诱导食管癌大鼠外周血CD4+CD25+Tr细胞比例增加，CD4+T细胞比例降低，与正常对照组比差异显著，提示食管癌大鼠免疫功能失调与其外周血调节T细胞比例增加有关。诱癌15周时大鼠外周血中CD4+CD25+ Tr细胞水平高于诱癌9周水平，提示食管癌大鼠调节性T细胞介导的免疫耐受和肿瘤的生长密切相关，可能直接参与肿瘤进展过程。因此，CD4+CD25+Tr细胞比例可较好反映抗肿瘤细胞免疫功能。经LBP预防性治疗后，在诱癌9周和15周大鼠外周血中CD4+T细胞、CD4+CD25+Tr细胞占淋巴细胞的比例均有不同程度恢复，与模型组比较差异有显著性。说明LBP可以通过抑制CD4+CD25+Tr细胞活化来纠正食管癌发生、发展过程中所致免疫细胞受抑状态，从而达到纠正食管癌大鼠免疫功能紊乱的作用。
       Tr 细胞活化后它可分泌大量的 IL-10、TGF-β1 等抑制性细胞因子 [5]。这些细胞因子具有抑制抗原呈递细胞及拮抗效应性 T 细胞的功能,在Tr细胞介导的免疫耐受及Tr细胞的产生和增殖中发挥着重要作用 [6，7]。有研究认为Tr通过分泌IL-10 的方式对效应性T细胞抑制作用更明显[8]。本研究结果显示，NMBA诱导食管癌大鼠外周血IL-10含量显著增加，经LBP预防性治疗后，食管癌大鼠外周血IL-10的分泌显著下降。IL-10可通过下调APC细胞上MHC II类分子以及DC上共刺激分子的表达而损伤其抗原提呈能力，抑制细胞免疫。而LBP可能是通过下调CD4+CD25+T细胞分泌IL-10,从而纠正了细胞免疫功能的紊乱。
       IL-2是Th1细胞分泌的主要淋巴因子,在抗肿瘤免疫中发挥着重要作用。Nakayama等[9]研究表明,胃肠肿瘤患者肿瘤引流淋巴结和外周血中IL-2的产生明显减少,这是由于该部位的CD4+Th1型细胞减少,Th2细胞增多所导致。本实验结果表明，肿瘤模型组外周血的IL-2水平明显低于正常组，经 LBP治疗后, IL-2的产生明显增加。有助于免疫系统发挥抗肿瘤作用。Nakayama等[9，10]概述,提高IL-2等细胞因子水平,能够增强T细胞的激活信号,解除肿瘤对T细胞的抑制作用,并促进T细胞对肿瘤抗原的反应,是提高机体抗肿瘤作用的有效方法。
       本研究结果证实,LBP能抑制大鼠食管癌外周血中CD4+T细胞比例升高，CD4+CD25+Tr细胞比例降低， IL-10分泌减少而IL-2的分泌增加，显著改善实验性食管癌大鼠细胞免疫功能障碍。该实验结果提示,LBP可作为BRM,发挥免疫调节功能而增强抗肿瘤作用，但其具体的作用机制尚需进一步研究证实。
       【参考文献】
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