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       【摘要】 
       目的观察麋鹿角醇提液对D-半乳糖(D-gal)诱导衰老模型小鼠细胞因子的影响。方法取ICR小鼠54只，雌雄兼用，随机分成4组：正常对照组(NG，n=12)，模型对照组(MG，n=14)，麋鹿角醇提液低剂量组(LG，2 g·kg-1·d-1，n=14)，麋鹿角醇提液高剂量组(HG，4 g·kg-1·d-1，n=14)。正常对照组给予背部皮下注射生理盐水，其余各组用D-半乳糖(D-gal)按120 mg·kg-1·d-1背部皮下注射6周，造成亚急性衰老模型。造模同时，麋鹿角醇提液低剂量组和高剂量组分别给予相应浓度的麋鹿角醇提液，正常对照组和模型对照组给予相同容积的0.5% 羧甲基纤维素钠(CMC)。采用ELISA法检测血清中细胞因子IL-2，IFN-γ的浓度，RT-PCR法检测脾淋巴细胞IL-2，IFN-γ mRNA的表达。结果模型组小鼠血清中IFN-γ浓度降低，IFN-γ基因表达水平下降。而麋鹿角醇提液能升高模型组小鼠血清中IL-2和IFN-γ的浓度，并增强模型小鼠脾淋巴细胞IL-2，IFN-γ mRNA的表达。结论麋鹿角醇提液能促进D-gal诱导的衰老模型小鼠细胞因子IL-2，IFN-γ的分泌与表达，增强其细胞免疫功能。
       【关键词】  麋鹿角; 衰老模型; D-半乳糖; 细胞因子; 白介素2; γ干扰素
       麋鹿角为鹿科动物麋鹿Elaphurus davidianus Milne-Edwards的骨化老角，又称麋角。据古代本草记载，麋鹿角具有“强筋骨、益血脉”，“补元脏、驻颜色”的功效[1,2]。由于多种原因导致麋鹿在我国已近绝灭，几乎无药可用。如今，人工繁殖技术的成功确保了药用资源和生态环境的协调发展，为麋鹿角恢复药用提供了来源[3]。目前，江苏大丰糜鹿保护区麋鹿已由1986年的39头繁殖到1300多头，并且野生放养自然繁殖成功，野生种群数达100多头，每年自然脱落下来的麋鹿角也越来越多，现已达3000多公斤，这为其开发研究提供了充足的物质基础。现代药理学研究发现麋鹿角的乙醇提取物具有耐疲劳、抗衰老的药理作用[4]。另外研究还发现麋鹿角醇提液对正常小鼠体液免疫、细胞免疫功能都有一定的促进作用[5]。但麋鹿角对于衰老小鼠细胞因子是否有影响未见文献报道。本实验使用D-半乳糖造成亚急性衰老模型，观察麋鹿角醇提液对衰老小鼠细胞因子的影响，旨在为麋鹿角的开发利用提供相关的科学依据，以尽快恢复麋鹿角的药用价值。
       1 材料与仪器
       1.1 动物ICR小鼠54只，体质量(18±2)g，雌雄兼用，由南通大学动物实验中心提供，合格证：SYXK(苏)2007-0021。
       1.2 受试药物配制及试剂麋鹿角，由江苏大丰麋鹿保护区提供，将麋鹿角刨片、粉碎成约100目粉末，准确称取麋鹿角粉末200 g，加入70%乙醇溶液浸泡3次，48 h/次，合并浸泡液并过滤，然后减压蒸馏，浓缩至80 ml，即为麋鹿角乙醇提取浓缩液，浓度为2.5 g/ml。用0.5%羧甲基纤维素钠(CMC)溶液配制成所需浓度的麋鹿角醇提液备用。D-半乳糖为美国Amerisco公司产品，IL-2与IFN-γ的ELISA试剂盒为eBioscience公司产品。TRIZOL Reagent，加拿大BBI公司产品。DNA酶(DNase I)，Worthington公司原装。Oligo(dT)15，M-MLV逆转录酶，dATP,dTTP,dCTP,dGTP为Promega公司产品。Taq DNA polymerase为BBI公司产品，DL-2000 DNA Marker，TaKaRa公司产品。
       1.3 仪器PTC-100 PCR仪，美国MJ.RESEARCH.INC产品;小源凝胶图像分析系统，上海小源科技有限公司产品;核酸蛋白分析仪，Eppendorf基因有限公司产品。
       2 方法
       2.1 分组与给药54只ICR小鼠，雌雄兼用，体质量(18±2)g，随机分成4组：正常对照组(NG，n=12)，模型对照组(MG，n=14)，麋鹿角醇提液低剂量组(LG，2 g/kg，n=14)，麋鹿角醇提液高剂量组(HG，4 g/kg，n=14)。正常对照组按0.1 ml/10g给予背部皮下注射生理盐水，其余各组用D-gal按120 mg/kg背部皮下注射6周，1次/d，造成亚急性衰老模型。造模同时，麋鹿角醇提液低剂量组灌胃生药剂量2 g/kg麋鹿角醇提液(0.2 g/ml麋鹿角醇提液，给药容积0.1 ml/10g)，高剂量组给予灌胃生药剂量4 g/kg麋鹿角醇提液(0.4 g/ml麋鹿角醇提液，给药容积0.1 ml/10g)，正常对照组和模型对照组给予相同容积的0.5% 羧甲基纤维素钠。
       2.2 ELISA法检测血清中细胞因子IL-2，IFN-γ的浓度取待测血清，按eBioscience公司提供的ElISA试剂盒中的方法测定血清中细胞因子IL-2，IFN-γ的浓度。
       2.3 RT-PCR检测脾淋巴细胞IL-2，IFN-γ mRNA的表达用Trizol常规提取各组脾淋巴细胞的总RNA，用无RNA酶的DNase I处理后，按照Promega公司提供的逆转录酶使用说明书合成cDNA第一链。然后PCR法分别扩增IL-2，IFN-γ基因，β-actin作为内参基因。其引物序列如下：IL-2 上游引物5"-aacctgaaactccccaggat-3"，下游引物5"-tccaccacagttgctgactc-3" 预期扩增长度254bp;IFN-γ上游引物5"-actggcaaaaggatggtgac-3"，下游引物5"-tgagctcattgaatgcttgg-3"，预期扩增长度为237bp;β-actin(β肌动蛋白)上游引物 5"- gagagggaaatcgtgcgtga -3" ，下游引物5"- agtacttgcgctcaggagga -3" 预期扩增长为400bp。PCR总反应体系为25μl：10×PCR Buffer 2.5μl，cDNA模板1μl，引物(上下游混合，各10μmol/L)1μl, dNTP mix(10mmol/L)0.5 μl，MgCl2 (25mmol/L) 2.0 μl，Taq酶(5U/μl)0.2 μl，ddH2O 17.8 μl 混匀后稍离心，执行PCR程序。PCR反应参数如下：IL-2基因扩增参数为94℃ 4min，94℃ 35s→54℃ 30s→72℃ 30s，循环31次后，在72℃延伸7min，每管适时加入内参β-actin引物，内参扩增26次。IFN-γ基因扩增参数为94℃ 4min，94℃ 35s→53℃ 35s→72℃ 40s，循环31次后，在72℃延伸7min，每管适时加入内参β-actin引物，内参扩增26次。PCR产物于1.5%琼脂糖电泳，电泳结束后使用小源凝胶分析系统拍照获得凝胶电泳图像，使用Scion Image图像分析软件进行PCR产物条带分析。为减少误差，以目的基因与内参的比值代替目的基因进行分析。计算方法：目的基因条带灰度相对值=(背景灰度值-目的基因条带灰度值)/(背景灰度值-内参基因条带灰度值)。
       2.4 统计方法数据用±s表示，用SPSS11.0统计软件，采用方差分析，组间比较采用t检验。以P<0.05作为统计显著性差异标准。
       3 结果
       3.1 血清中细胞因子IL-2，IFN-γ的浓度见表1。与正常对照组相比，模型组IFN-γ浓度下降，差异具有显著性(P<0.05)，而IL-2有下降趋势但未达统计学意义(P>0.05)。而麋鹿角醇提液低剂量组与高剂量组均能升高模型组小鼠血清中IL-2和IFN-γ的水平，且均有统计学意义。表1 麋鹿角醇提取液对D-gal衰老模型小鼠细胞因子的影响
       3.2 脾淋巴细胞IL-2，IFN-γ 基因的表达IL-2 mRNA表达如图1所示，模型组与正常对照组比较有降低趋势但差异没有显著性[(0.551±0.135)vs(0.866±0.251),P>0.05],低剂量组与模型组比较有升高趋势但没有差异显著性[(0.770±0.069)vs(0.551±0.135),P>0.05], 高剂量组与模型组比较，IL-2水平升高1.55倍，差异有统计学意义[(0.855±0.125)vs(0.551±0.135),P<0.05]。IFN-γ 基因表达如图2所示，模型组与正常对照组比较,IFN-γ mRNA水平显著下降[(0.477±0.058)vs(0.963±0.113),P<0.01]。而低剂量组与高剂量组均能显著升高模型鼠IFN-γmRNA的表达，其丰度比值分别为2.57倍[(1.226±0.146)vs(0.477±0.058),P<0.01]和3.08倍[(1.470±0.092)vs(0.477±0.058),P<0.01]。
       4 讨论
       麋鹿角为古方记载之传统补益类名贵中药，现代生药学研究证实其含有丰富的氨基酸，维生素以及矿物质[6] ，药理学研究也证实麋鹿角醇提液能增强正常小鼠的单核吞噬细胞功能，提高免疫器官的指数，增强小鼠溶血素形成的能力，提高经PHA诱导的小鼠T淋巴细胞转化率，具有增强正常小鼠体液免疫以及细胞免疫功能的作用[5] 。细胞因子(cytokine, CK)是由免疫活性细胞及其相关细胞(巨噬细胞、成纤维细胞和内皮细胞)产生，为具有多种重要生物活性的细胞调节蛋白。CK作为细胞间接传递信息的分子语言，参与免疫应答的全过程，包括感应阶段，淋巴细胞活化，增殖、分化阶段以及免疫效应阶段，在免疫调控中起着重要作用[7] ，麋鹿角对细胞因子是否有影响还不清楚。本实验观察了麋鹿角醇提液对衰老小鼠细胞因子IL-2和IFN-γ的影响。
       随着年龄的增加，免疫器官老化，免疫细胞及细胞因子数量发生改变，机体免疫功能逐渐减弱，易发生感染性疾病、肿瘤、自身免疫病及一些老年病[8] 。D-半乳糖致亚急性衰老已为多方所证实[9] 。D-半乳糖致衰老动物模型对免疫指标的变化与人体衰老指标改变规律基本一致，文献报道D-半乳糖复制衰老小鼠模型各项免疫指标异常，如免疫器官萎缩，淋巴细胞转化能力降低，巨噬细胞吞噬功能下降，外周血IL-2含量降低等，较好地反映了衰老的病理特征[10] 。本实验使用D-半乳糖诱导衰老模型小鼠血清细胞因子IFN-γ浓度下降且脾淋巴细胞IFN-γ mRNA表达显著下调，说明模型复制成功。白介素2(IL-2)和γ 干扰素( interferon gamma, IFN-γ)都是主要由活化的T 淋巴细胞产生的细胞因子，具有强大的免疫调节作用。IL-2具有促进T 细胞增殖分化，增强T 细胞、NK 细胞活性，诱导干扰素生成的作用。IFN-γ 可增强抗原提呈细胞与T 细胞的相互作用，进而增强T 细胞辅助抗体产生，可活化巨噬细胞，促进其杀伤病原体和肿瘤的能力，并可活化NK 细胞，提高其杀伤能力。IL-2 和IFN-γ 水平的高低是机体细胞免疫的重要标志[11，12] 。
       本研究发现麋鹿角醇提液能够升高小鼠血清中IL-2和IFN-γ 的浓度，并增加小鼠脾淋巴细胞因子IL-2，IFN-γ mRNA的水平。结果说明麋鹿角醇提物能基于分子转录水平增加衰老小鼠脾淋巴细胞IL-2，IFN-γ 基因的表达，从而促进IL-2以及IFN-γ的蛋白合成，使其分泌增加，故其在血清中浓度升高。这些反映出麋鹿角醇提液对衰老小鼠的细胞免疫功能有一定的促进作用。
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