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       【摘要】 
       目的黄芩是具有多种药理作用的药用植物，其主要化学成分为黄酮类化合物,其中黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷和汉黄芩素是发挥药理作用的活性成分。文章概述了近五年来国内外有关黄芩中黄酮类活性成分制备工艺，并对黄酮类化合物的检测方法进行了总结，为全面开发利用黄芩提供参考。
       【关键词】  黄芩; 活性成分; 制备; 检测
       黄芩为唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensis Leorgi的干燥根。黄芩又名腐肠、泾芩、条芩等，多年生草根植物，主产于黑龙江、吉林、辽宁、河北、山东、四川、云南、山西、甘肃等地，以山西产量最大，河北承德产的质量最好[1]。具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗氧化、抗爱滋病、抗糖尿病及其并发症、抗肿瘤、抗过敏、清除自由基、降血脂、提高机体免疫力等多种药理作用，对免疫、心血管、消化、神经等多系统均有保护作用[2]。因此，国内外许多学者在生产和制备高纯度的黄芩活性成分单体方面进行了大量的研究工作。本文就近五年来国内外对黄芩中黄酮类活性成分的制备工艺和检测方法的研究现状作一综述。
       1 黄芩的活性成分
       黄芩的化学成分主要集中在黄酮、苷、萜、微量元素、酶、甾醇和有机酸等几大类化合物[3， 4]。对黄芩中黄酮类化合物的研究报道始于1891年日本学者高桥顺太郎，其后日本学者柴田和潼户等分别从黄芩中分离并鉴定了黄芩素、汉黄芩素、黄芩苷、千层纸素、千层纸甲素苷和黄芩黄酮-1。随后，黄芩素-7-D-糖苷，黄芩黄酮-II，5,7-二羟基-6-甲氧基双氢黄酮，白杨黄素及其苷，木蝴蝶素A及其葡萄糖醛酸苷，二羟基木蝴蝶素A，2",5,8-三羟基-7-甲基黄酮，2",5,8-三羟基-6,7-甲基黄酮，4",5,7-三羟基-6-甲氧基双氢黄酮及新化合物，2", 6",5,7-四羟基双氢黄酮，2",6",3,5,7-五羟基双氢黄酮等等化合物相继被分离提取[2～4]。迄今已分离出四十多种，其中黄芩苷(baicalin， C21H18O11)，黄芩素(baicalein, C15H10O5)，汉黄芩苷(wogonoside, C22H20O11)和汉黄芩素(wogonin, C16H12O5)是最主要的活性成分，是其发挥药理活性的基础，尤其以黄芩苷最强。其结构式见图1。
       于晶[1]、周晓宁等[5]对取自黑龙江、吉林、内蒙古、河北、山东和陕西等不同产地、不同种源的黄芩中黄酮类化合物的含量进行了测定，其含量变化范围分别是：黄芩苷6%～19%，汉黄芩苷2%～8%，黄芩素0.1%～0.6%，汉黄芩素0.01%～0.3%。黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素的含量有较大差异。其中山东和山西所产黄芩中黄芩苷含量最高，且汉黄芩苷和黄芩素含量较高。黄芩根中黄芩苷和汉黄芩苷的含量明显高于地上部分，黄芩苷以5月采收最高(7.6%)，汉黄芩苷以9月采收最高(4.1%) [6]。
       2 活性成分的制备
       为提高中药质量，改变传统中药剂型“大、黑、粗”的状态和提高现有中草药资源的利用率，让中药步入国际市场，提出了中药现代化理念，其重要内容之一是中药生产过程中提取浓缩、分离纯化等关键技术的现代化。
       图1 黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素化学结构式
       2.1 活性成分的提取工艺中药的传统提取方法有煎煮法、浸渍法、渗滤法、改良明胶法、回流提取法、水蒸气蒸馏法等。其中水煎煮法是最常用的方法。传统方法存在较多的缺点：①煎煮法有效成分损失较多，尤其是水不溶性成分;②提取过程中有机溶剂有可能与有效成分作用，使其失去原有效用;③非有效成分不能被最大限度的除去，浓缩率不够高;④提取液中除有效成分外，往往杂质较多，尚有少量脂溶性成分，给精制带来不利;⑤高温操作会引起热敏性有效成分的大量分解。
       随着科学技术进步，黄芩中黄酮类物质的提取浓缩、分离纯化技术得到不断完善和改进，产生了超临界流体萃取法、超声提取法、微波提取法、酶提法、加压逆流提取法等浸提新方法、新技术。其主要提取方法如下。
       2.1.1 改良浸提法到目前为止，黄芩素的提取多采用浸渍法。梁英等[7]以黄芩黄酮得率为试验指标，采用4因素二次回归正交旋转组合设计对黄酮回流浸提工艺参数进行优化研究，建立了黄芩黄酮得率与浸提时间、浸提温度、颗粒粒度和液固比之间关系，发现浸提时间为1.6～1.9 h，温度为72.5～76.9℃，颗粒粒度为65.2～74.0目，液固比为24.9～27.2 ml/g时黄芩素得率大于11.00%的概率为95%。与实际情况拟合较好，为黄芩素浸提工艺条件的确定提供了量化基础。
       2.1.2 超声提取法超声能产生空化效应，具有粉碎、搅拌等特殊作用，使黄芩植物组织在溶剂中瞬时产生的空化泡崩溃，从而使组织中的细胞破裂，有利于溶剂渗透进植物细胞内部，使细胞中的黄芩苷成分进入水溶剂中，加速相互渗透、溶解，提高黄芩苷在水中的溶解度。丁芳林等[8]在正交实验基础上考虑生产成本，改变固液比进行试验。结果发现固液比为1∶12，超声2次，每次25 min，就达到了满意的结果。王胜男[9]用正交设计结合单因素分析方法考察超声循环提取黄芩苷的最佳提取工艺条件为：80目黄芩粉末，60%乙醇，40℃超声循环提取3次，40 min/次，超声功率为100 W，各因素对黄芩苷收率的影响依次为：提取次数>超声功率>提取温度。该法具有实验设备简单，操作方便，提取无需加热、时间短，提取率高、污染少等特点，优于传统的醇提酸沉法。但会使黄芩苷被酶水解成黄芩素和葡萄糖醛酸，因此提取前应设法灭活酶。
       2.1.3 树脂吸附法大孔树脂吸附技术是利用一类有机高聚物吸附剂吸附溶液中有效成分的方法，20世纪70年代末开始应用于中草药化学成分的提取分离，在中草药有效成分的提取分离及成分测定方面已显示出其独特的作用。冯云霞等[10]依据目标产物的不同选择不同的树脂类型、pH值、流速和洗脱剂综合考察黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素4种成分的结果，确定了SP～825为最佳树脂，pH6.5的样品液在ZBV/h流速下上样，并以丙酮洗脱为最佳分离工艺。树脂法提取率高，含量也高，成本低，易于工业化生产。但树脂的处理比较困难，而且可能造成产品污染。
       2.1.4 微波提取法微波是一种超高频电磁波(24.5亿次/s)，具有很强的穿透作用，可以使药材颗粒内外迅速地同时均匀加热，加速药材内分子间相互碰撞，挤压等，有利于中药材有效成分的浸出，加速有效成分的提取，并提高其提取产率。程存归等[11]运用微波辅助提取法提取黄芩中的黄芩苷，得出的最佳工艺为黄芩原材料粉碎粒度200目、溶剂为60%乙醇溶液、微波辐射时间8 min。微波提取与传统热提取、水提酸沉淀法和溶剂提取法相比具有质量稳定、操作简便、省时、提取率高和平行性好等特点。浸出过程中，药材细粉不凝聚，不焦化，克服了煎煮散剂易凝聚，易焦化的不足。
       2.1.5 超临界流体萃取法(Supercritical Fluid Extraction，SFE)超临界萃取技术是指利用超临界状态(高渗透能力和高溶解能力)下的流体为萃取剂，从液体或固体中萃取药材中有效成分并进行分离的方法，20世纪90年代被应用于中药提取分离领域，与传统方法比较，提取率明显提高，且提取物成分达到100 %的“全天然”。徐志宏等[12]用亚临界水提取(subcritical water extraction,SBW)法以黄芩苷为标志性化合物对黄芩进行提取，并与有机溶剂回流提取法(organicsovent extraction,OSE)比较。结果表明，当两者具有同等提取效果时，亚临界水提取法的提取时间及提取溶剂的消耗量大大减少，为黄芩苷的提取提供了一种有效的方法。该技术具有提取时间短、提取率高、产品不含有害物质、无污染、操作温度低而有利于热敏性、易氧化生物活性成分的保留等优点。但是，一次性设备投资费用与传统工艺设备投资相比仍较大，这也是影响超临界流体提取技术在中药提取工业化生产应用推广的主要原因。
       2.1.6 酶水解法黄芩中黄芩素含量较低，直接从黄芩中提取黄芩素很困难，但是黄芩中富含黄芩苷，因此可以使用酶水解黄芩苷制取黄芩素。刘云华等[13]研究了从黄芩中提取分离黄芩素的酶解条件和提取工艺。结果表明，黄芩药材粉碎至10～20目，加水6倍，于60℃保温10 h;酶解后的黄芩药材加8倍70%乙醇回流提取2次，1 h/次，黄芩素的提取率大于70%，工艺稳定可行。利用正交实验，以黄芩素的含量为评价指标，确定了从黄芩中提取黄芩素的最佳酶解工艺和提取工艺。研究发现，酶解温度为40℃，pH 6.0，时间12 h时，黄芩素含量最高;超声提取30 min，2次，乙醇加入量为15倍时，黄芩素的含量可76.5 mg/g。
       2.1.7 纤维素酶法由于黄芩药材的细胞壁大多是由纤维素构成的，其有效成分往往包裹在细胞壁内，纤维素是β-D-葡萄糖以1，4-β-糖苷链连接的，用纤维素酶可破坏β-D-葡萄糖键，进而有利于有效成分的提取。王宏志等[14]应用纤维素酶对黄芩药材进行酶解，优选最佳工艺条件，以提高黄芩素、汉黄芩素的提取率。确定了纤维素酶解黄芩药材的最佳工艺条件：浸提倍数20，加酶量20U/g药材，pH4.8，温度50℃，时间8 h。与传统水煎提取工艺相比，酶法提取工艺提取使得黄芩中黄芩素提取率提高了5倍、汉黄芩素提取率提高了近4倍。
       2.1.8 其它方法除以上几种提取技术外，酸沉淀法(包括水提碱溶酸沉淀法、醇提酸沉淀法、碱提酸沉淀法、碱醇胶胨酸沉淀法)、脱脂醇提法、分级提取法、水提取醇沉法、液-液连续萃取法等提取技术均在黄芩有效成分的提取分离过程使用。
       2.2 活性成分的分离、纯化与鉴定
       2.2.1 超滤(UitraFiltration，UF)法超滤技术是20世纪60年代发展起来的一门科学，是一种以分离、纯化和浓缩物质的新方法。超滤技术是在nm数量级进行选择性膜过滤分离技术。1993年始用于提取黄芩苷。王轶晶等[15]比较了经微波提取后，分别用酸沉法、超滤法、大孔树脂法3种方法分离纯化黄芩苷的纯度和得率，结果是微波提取超滤柱过滤可以明显提高黄芩苷的纯度和得率(88.06%)，但明显高于酸沉法78.58%。该方法具有生产工艺简单、分离效能高、常温操作、节省能源、周期短、无污染等特点，更适宜于大生产。而且超滤法提取工艺可直接脱去色素，提纯产品，省去了再行精制、活性炭脱色等工序，而且收率高，可使成本大大降低，明显提高经济效益。
       2.2.2 色谱法(层析法)柱色谱法( Column chromatography)　蒋建军等[16]采用酸沉碱溶法从黄芩中提取黄芩苷，通过水解黄芩苷制取黄芩素粗品,再经硅胶和聚酰胺柱层析纯化，得高纯黄芩素(纯度为99.35%)，其最佳条件为黄芩苷在20%盐酸水溶液中为2 %( 质量分数)，反应温度为37℃，反应时间为1.5 h，黄芩素的产率为89.86%。陈翠丽等[17]将黄芩用索氏提取法所得膏体进行柱色谱分离，并比较了以石油醚-醋酸乙酯，氯仿-甲醇，氯仿-醋酸溶剂体系进行梯度洗脱对汉黄芩素得率的影响。分离效果显示，石油醚-醋酸乙酯洗脱效果最好，汉黄芩素单体得率最高，达2%以上，其它几种溶剂作洗脱剂，得率仅0.9%～1.6%。该方法简单，所用主要药品为常规试剂，成本较低，且对环境无污染，汉黄芩素产品的得率也较高，因此该工艺有较高的参考价值和应用前景。
       薄层色谱法(Thin-layer chromatography)：薄层色谱法是药物分析中广为应用的经典方法，展开剂多为有机溶剂。刘源[18]、蔡清宇[19]等用聚酰胺膜，以甲苯-醋酸乙酯-甲醇-甲酸(10∶3∶1∶2)为展开剂，分离和检测黄芩中黄酮类成分，建立了一种新型的色谱技术，可以简便、准确、高效地分离和鉴定黄芩苷等黄酮类成分。
       高速逆流色谱法(high-speed counter-current chromatography method)：高速逆流色谱法(HSCCC)是一种新型的基于液-液分配原理的色谱分离技术，具有样品无损失、无污染、高效、快速和大制备量分离等优点，HSCCC 技术在中草药成分分离分析方面的应用尚属起步阶段。近年来，随着仪器、方法的改进，国内外文献报道已利用该技术分离分析生物碱、黄酮、蒽醌、皂苷、木脂素、蛋白质、胡萝卜素类等成分。李华斌等[20]用以正己烷-乙酸-丁醇-水为展开剂(1∶1∶8∶10)，上相为固定相，下相为流动相，有效的分离纯化黄芩中的黄芩素(纯度95.7%)、汉黄芩素(纯度98.5%)等黄酮类化合物。
       2.2.3 树脂法用树脂吸附分离黄芩苷的研究报道不多，近年才有人做了这方面的研究工作。王轶晶等[15]用黄芩酸沉-D101树脂-酸沉分离纯化黄芩苷，纯度为86.61%，略低于超滤法但明显高于酸沉法78.58%。
       2.2.4 其他除以上几种分离技术外，分步结晶法、超临界色谱法、溶剂萃取法、液滴逆流色谱法、离心板色谱等分离技术也已运用到中药有效成分的分离过程中，并取得了良好的分离效果。
       3 活性成分的含量检测方法
       国内外针对其主要的黄酮类化合物建立了不少定量分析方法，如分光光度法(薄层洗脱-紫外分光光法、双波长紫外分光光度法、一阶导数-分光光度法)、薄层层析法、导数光谱法、脉冲极谱法、二阶导数差示脉冲极谱法、系数倍率法、红外光谱法、黄芩苷-聚氯乙烯膜电极法、薄层扫描法、高效液相色谱法等。其中薄层扫描法和高效液相色谱法最简便、准确，被2000版和2005版《中国药典》推荐使用。
       3.1 薄层扫描法薄层扫描法是2000版《中国药典》黄芩苷的含量测定方法，是将含有黄芩苷的样品在薄层板上经层析分离后，直接在薄层扫描仪中测定，由回归方程计算出含量。避免了人手刮取斑点洗脱的缺点，不受其他成分干扰，较紫外分光光度法简便，准确。薛满等[21] 用聚酰胺薄膜，以醋酸乙酯-丁酮-甲酸-水(5∶3∶1∶1)作展开剂，采用双波长反射法锯齿扫描(λ3=278 m，λR=370 nm).，检测黄芩苷含量。点样量在0.217～1.083 μg/ml范围内呈良好的线性关系，平均加样回收率为101.60%，RSD= 2.50% (n=5)。
       3.2 高效液相色谱法( high performance liquid chromatography , HPLC)由于黄芩中苷类与其苷元在极性和含量上的差异，很难用单一的方法使几种成分都达到满意的分离和测定效果，采用高效液相色谱法就可以较好地解决这个问题，因此高效液相色谱法成为2005年版《中国药典》黄芩中黄芩苷的含量测定方法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为甲醇-水-磷酸(47∶53∶0.2)，检测波长为280 nm，理论塔板数按黄芩苷峰计算不低于2500。GyKovucs[22]、宋卫青[23] 、宋双红[24]、任玲玲[25]等分别采用HPLC分析了不同产地黄芩中黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素的含量，色谱柱Shimadzu C18(4.6 mm×150 mm，5 μm );测定黄芩中苷类流动相用甲醇-水-冰醋酸(47∶53∶0.2)，检测波长280 nm，流速1.0 ml/min，柱温25℃;测定苷元类用甲醇-乙腈-0.4%的冰醋酸水溶液(30∶20∶50)，检测波长275 nm;流速1.0 ml/min，柱温40℃。结果表明黄芩苷在0.1～1.0 g范围内进样量与峰面积呈现良好的线性关系，平均加样回收率为98.2%～100.6%，RSD= 2.21%～2.3%。应用高效液相色谱法对中药制剂中黄芩苷的含量测定，样品不用事先进行分离，简便，准确，重复性好，是目前黄芩苷定量分析方法中较为优越的的方法，也是质量控制中较常用的方法。
       3.3 反相高效液相色谱法(RP-HPLC法)反相高效液相色谱是迄今为止HPLC中使用最广泛的技术，因为它能应用于大部分的非极性化合物、许多可电离的及离子化合物的分析。张箭[26]等对药典中黄芩苷的测定方法进行了改进，用RP-HPLC方法，C8色谱柱(5 μm, 200 mm × 4.6 mm)，流动相为水-乙腈-甲醇(54∶28∶18，V/V/V，含0.5%三乙铵，pH 2.8)，检测波长276 nm。在30 min内完成黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素和千层纸素A的分离和含量测定，每种成分在各自的浓度范围内均具有良好的线性相关性;加样回收率为99.0%～104.6%，其相对标准偏差为1.65%～3.52%。本法操作简便，快速，结果准确。
       4 结语
       随着全球疾病谱和医疗模式的变化和化学合成药带来的不良反应，人们对从天然药用植物中寻找有效药物来维护健康或防治疾病充满了期望。黄芩是来源于自然的传统中药，在我国已使用了上千年，安全无害。其主要有效成分黄芩苷已制成黄芩苷及黄芩苷片、黄芩苷注射液、黄芩苷胶囊等，在临床上被广泛应用于抗炎、抗病毒、降血脂、抗肿瘤等疾病的治疗，深入广泛地开发黄芩资源的种植及有效成分的提取、分离和纯化必将有着美好的前景。
       虽然黄芩的化学组成和药物应用价值研究已取得一定进展，但仍存在许多未知的东西。比如：它在这些作用方面的细胞分子水平的作用机理是什么?药物作用的靶标在何处?随着对黄芩活性成分的逐渐认识，黄芩资源日益供不应求，如何使黄芩资源可持续利用?等问题将是今后研究的重点。同时，还应进一步研究活性成分的药效与剂量和剂型之间的关系，提高生物利用度，以利于更好地开发利用。
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