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       【关键词】  车前草；,,乌索酸；,,齐墩果酸；,,高效液相色谱法
       摘要：目的采用反相高效液相色谱（RP-HPLC）法测定车前草中主要成分乌索酸和齐墩果酸的含量。方法采用高效液相色谱法。使用Nova-Pak C18柱（3.9 mm×300  mm，4 μm)，流动相为甲醇：水(88：12，V/V)，流速为0.8 ml/min，检测波长为210 nm，柱温25 ℃。结果乌索酸在0.456~4.104 μg范围内呈良好的线性关系(r=0.999 7)，平均回收率为98.2 %，RSD=1.1 %；齐墩果酸在0.156~1.384 μg范围内呈良好的线性关系(r=0.999 6)，平均回收率为101.6％，RSD=1.7％。结论方法灵敏、准确、专属性强，重现性好，可作为车前草药材的质量控制方法。
       关键词：车前草；  乌索酸；  齐墩果酸；  高效液相色谱法
       Determination of Ursolic Acid and Oleanolic Acid in Plantago asiatica L.by RP-HPLC
       ZOU Sheng-qin
       (Key Laboratory of Jiangxi Province for Research on Active Ingredients in Natural Medicines, Bioengineering Institute of Yichun University,Yichun, Jiangxi 336000，China）
       Abstract:ObjectiveTo establish a method for determining ursolic acid and oleanolic acid in Plantago asiatica L. by high performance liquid chromatography. MethodsThe separation was carried out on Nova-Pak C18 column（3.9 mm×300 mm, 4 μm) with methanol -water (88:12,V/V) as the mobile phase，at a flow rate of 0.8 ml/min. The detection wavelength was set at 210 nm. The column was used at 25℃. ResultsUrsolic acid showed a good linear relationship in the range of 0.456~4.104 μg (r=0.9997) and the average recovery was 98.2 %, RSD was 1.1% . Oleanolic acid showed a good linear relationship in the range of 0.156~1.384 μg (r=0.999 6) and the average recovery was 101.6 %, RSD was 1.7%．ConclusionThe method is sensitive,accurate and specific with a good repeatability and can be used for the quality control of Plantago asiatica L.
       Key words:Plantago asiatica L；  Ursolic acid；  Oleanolic acid；  HPLC
   
　　车前草，又名车前、牛舌菜、五根草、当道、鱼草等，为车前科植物车前 Plantago asiatica L. 或平车前 Plantago degresa Willd. 的干燥全草。多年生草本，叶片形状如饭匙，五条明显的弧形叶脉，淡绿褐色穗状花序，数支花茎凸出于饭匙形叶片中间地带，形状特殊，极易辨识，为中医常用药物。车前草主要含有桃叶珊瑚苷、芳香醇、香芹酚、车前苷、乌索酸、齐墩果酸、β-谷甾醇、棕榈酸、β-谷甾醇脂、维生素等化学成分［1］。其药理活性广泛，有利水通淋、清热名目、护肝降压、降低血清胆固醇、祛痰、抗菌、抗炎、抗肿瘤等作用。临床上用来治疗尿频、尿急、尿血、肾小球肾炎、脐炎、湿疮等疾病。近年来又发现其对治疗高血压病、慢性活动性肝炎［2~4］ 、产后尿潴留等［5］有较好作用。车前草资源丰富，用途广泛，且毒副作用小，有广阔的应用前景。我们采用 HPLC法对其抗肝炎、抗肿瘤、抗病毒、抗炎抑菌主要成分乌索酸和齐墩果酸的含量进行了测定，为控制药材质量提供依据。
       　　1  仪器与试药
       1.1   仪器美国 Waters515双泵型高效液相色谱仪，2996光电二极管矩阵检测器，77251进样阀，20 μl定量环，Enpower中文色谱管理系统， Nova-Pak C18色谱柱(3.9 mm×300 mm，4 μm，Waters公司)；RO-MB-10 D高纯水机（杭州永洁达膜分离设备厂）；FC204N电子分析天平(上海天平仪器厂)；202-26A型数显电热恒温干燥箱（上海阳光实验仪器有限公司），KS-150超声提取仪器 (宁波科盛仪器厂)。
       1.2  试药甲醇为色谱纯（上海陆忠试剂厂），水为高纯水，95%乙醇(分析纯，江西同盟试剂化工厂）。乌索酸和齐墩果酸对照品（中国药品生物制品检定所提供，批号：110742-200314，110709-200311，供含量测定用)。车前草购于江西省宜春市药材市场，经本所天然药物研究室鉴定为车前Plantago asiatica L.的干燥全草。
       　　2  方法与结果
       2.1    色谱条件色谱柱：Nova-Pak C18柱(3.9 mm×300 mm，4 μm，带保护柱)；流动相为甲醇：水（88：12，V/V)，流速为0.8 ml/min；柱温为25 ℃；检测波长为210 nm。以美国药典方法计算，乌索酸和齐墩果酸理论塔板数均大于9 000。乌索酸和齐墩果酸对照品及车前草样品的 HPLC色谱见图1。
       图1  高效液相色谱图（略）
       2.2  对照品溶液的配制精密称取干燥至恒重的乌索酸对照品22.8 mg和齐墩果酸对照品7.8 mg，置于10 ml容量瓶中，加入适量甲醇溶解，用甲醇定容，得对照品储备液。精密吸取1 ml储备液置10 ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，混合均匀，制成乌索酸和齐墩果酸的浓度分别为0.228 μg/μl和0.078 μg/μl对照品混合溶液，备用。
       2.3  样品溶液的制备将车前草样品置烘箱中90℃烘干12 h，研细后精密称取约4 g，置于具塞三角烧瓶中，加入10倍量95%乙醇，采用超声法提取60 min，过滤，药渣洗涤两次，合并滤液于50 ml容量瓶中，加乙醇定容至刻度，摇匀。滤液用0.2 μm的滤膜过滤，得车前草提取物的样品溶液。
       2.4   线性范围实验分别精密吸取对照品的混合溶液2.0，6.0，10.0，14.0，18.0 μl进样分析，按2.1所述色谱条件测定峰面积，以对照品的进样量(μg)为横坐标，以峰面积（μV・s）为纵坐标，进行线性拟合，乌索酸和齐墩果酸的回归线方程分别为：Y乌索酸=5.18×105X-4.36×104 (r=0.999 7)，Y齐墩果酸=6.21×105X-6.32×104 (r=0.999 6) 。表明当乌索酸进样量在0.456~4.104 μg，齐墩果酸进样量在0.156~1.384 μg范围内线性关系良好
       2.5   精密度实验精密吸取对照品混合溶液10 μl，重复进样5次，分别测定峰面积值，计算得乌索酸的 RSD为0.9 %，齐墩果酸的 RSD为0.7 %，进样方法和仪器精密度良好。
       2.6  重复性实验取干燥至恒重的同一批车前草样品5份，按样品溶液制备方法制备样品溶液。精密吸取10 μl进样分析，乌索酸峰面积 RSD为2.1 %，齐墩果酸峰面积 RSD为 2.3 %。
       2.7   加样回收率实验精密称取干燥至恒重、已知乌索酸和齐墩果酸含量的车前草样品5份，每份约4 g，加入适量乌索酸和齐墩果酸对照品适量，5份样品同时按样品溶液制备方法提取，进样分析。乌索酸平均回收率为98.2 %，RSD为1.1 %，齐墩果酸平均回收率为101.6 %，RSD为1.7 %。
       2.8   样品的含量测定精密吸取车前草样品溶液10 μl，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，外标法计算样品中乌索酸和齐墩果酸的含量。结果见表1。
       　　3  讨论
       3.1  提取方法的选择从中草药中提取有效成分的常规方法主要有热提取法（热回流法、索氏法、煎煮法等）和浸泡法（渗滤法、冷热浸泡法等）两类［6］。超声提取法在提取过程中有空化，粉碎，搅拌等特殊作用，对植物药材的细胞具有破坏作用，溶媒渗透到药材的细胞中，使药材的化学成分易于溶入溶媒中［7］。它与常规提取方法相比，提取时间短，产率高，无需加热，降低溶剂消耗，更能节约能源，减少环境污染。
       表1  车前草提取物中乌索酸和齐墩果酸含量（略）
　
　　3.2  提取时间的确定 样品加入10倍量95 %乙醇溶液，分别超声提取45，60，90，120，150 min，预处理后测定提取液中乌索酸含量，60 min后乌索酸含量基本无变化，表明已提取完全，乌索酸平均加样回收率为98.2%，齐墩果酸的平均加样回收率为101.6%。
       3.3  检测波长的选择取乌索酸和齐墩果酸对照品混合溶液进样，在190～500 nm波长范围进行光谱扫描，其最大吸收波长均为201.0 nm，但由于流动相在短波长处有末端吸收，为了减少干扰，提高信噪比，提取不同波长的色谱图进行比较。选择210 nm为检测波长检测器响应值大，基线平稳，峰形好。结果见图2。
       图2  对照品的紫外光谱和不同波长的HPLC色谱（略）
       3.4  含量测定方法的建立车前草中乌索酸含量的测定方法一般采用薄层色谱法［8］，但由于两组分极性相差极小，用薄层色谱法难以分离，其结果往往是两组分的总含量。采用高效液相色谱法能同时测定乌索酸和齐墩果酸的含量，两组分得到良好分离，具有简便、准确、灵敏度高、稳定性和重现性好的优点。提取液经0.2 μm滤膜过滤后可直接进样分析，样品预处理方法简单，多次重复进样，未对色谱柱产生污染。
       　　参考文献：
       ［1］  田代华.实用中药辞典，上卷［M］.北京：人民卫生出版社,2002：325.
       ［2］  张  彤,柳淑玉,柳  晨.车前草的药理作用及临床应用进展［J］.时珍国医国药,2005，16(1)：67.
       ［3］  李开泉,陈  武,熊筱娟,等.乌索酸的化学、物理及临床应用进展［J］.中成药,2002，24(9)：709.
       ［4］  肖崇厚.中药化学［M］上海:上海科学技术出版社,1997：18.
       ［5］  陈文兰.车前草“十治”［J］.开卷有益・求医问药,2003,(1)：39.
       ［6］  袁  珂,李根林,李俊芝,等.车前草中熊果酸、齐墩果酸的HPLC测定［J］.中草药,1999，30(12)：901.
       ［7］  潘娓婕,李晓宁,张尊听,等.超声法从青风藤中提取青藤碱［J］.天然产物研究与开发,2002,15(2)：127
       ［8］  陈在敏,袁  欣.薄层扫描法测定车前草中熊果酸的含量［M］.海峡药学,1998,10(2)：47.

　　基金项目：国家“863”计划重点资助项目（No.2002AA2Z3217）
       （江西省天然药物活性成分研究重点实验室・宜春学院生物工程研究所，江西  宜春  336000）