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       【摘要】 
       目的探讨针刺对胶原性关节炎(Ⅱcollagen-induced arthritis，CIA)模型Cx43基因敲除小鼠治疗作用的途径及分子机制。方法用牛Ⅱ型胶原免疫野生型(Cx43+/+)及杂合型(Cx43+/-)小鼠，诱导关节炎建立CIA模型，初次免疫后第3周开始针刺治疗，观察其发病程度及外周血血清中肿瘤坏死因子α(TNF-α)的变化。结果针刺降低Cx43+/+ CIA小鼠关节炎指数和外周血TNF-α比Cx43+/- CIA小鼠明显(P<0.01)。结论针刺疗效与Cx43有关，通过缝隙连接蛋白起作用;抑制胶原性关节炎小鼠血清中的TNF-α;可能是其治疗类风湿关节炎的作用机制之一。
       【关键词】  针刺; Cx43; Ⅱ型胶原性关节炎; 肿瘤坏死因子-α
       Effects of Acupuncture on TNF-α in CIA of Cx43 Knockout Mice
       YAN Canqun1, ZHAN Kebin1, HYANG Guangying2, WANG Wei3
       (1.People"s Hospital of Liuzhou,Liuzhou,Guangxi 545000,China;2.Institute of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Affiliated Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan, 430030, China;3.Tongji Hospital,Huazhong University of Sciences and Technology,Wuhan 430030,China)
       Abstract：ObjectiveTo explore the therapeutic effect of acupuncture collagen-induced arthritis(CIA) in Cx43 knockout mice.MethodsHeterozygotes (Cx43+/-) and wild-types (Cx43+/+) mice were used to induce CIA mouse model. Acupuncture was carried out from the third week. At the same time, arthritis score and onset of arthritis was recorded. After treatment with acupuncture, swelling index of joint and serum TNF-α level were examined. ResultsThe results showed that acupuncture could decrease the swelling index of joints and level of TNF-α.ConclusionThe effect of acupuncture on CIA mice is associated with Cx43. To regulate the level of TNF-a is one of the main mechanism of acupuncture to treat RA.
       Key words：Cx43; Acupuncture; Ⅱ collagen induced arthritis; TNF-α
       具有二千五百余年历史的针灸疗法是我国传统医学的瑰宝，长期的临床实践已证实针刺对类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis，RA)的有效性，尤其是对关节疼痛的缓解和炎症的控制。近年来越来越多的实验研究和临床研究显示针灸能调节RA患者和模型动物的免疫和内分泌功能、改善血循环等[1]。前期的研究显示缝隙连接蛋白(Cx43)与经络有着高度的相关性[2～4]。本研究通过观察针刺对Cx43+/-和Cx43+/+ CIA小鼠的关节炎指数和血清中TNF-α的变化，在分子水平上探讨针刺在Cx43 CIA小鼠治疗作用中的途径和可能机制。
       1 材料与仪器
       1.1 动物及饲养条件Cx43基因敲除杂合型B6;129S-GjaltmlKdr/J小鼠(Cx43+/-) 从美国Jackson Laboratory购买，在其子鼠出生后第21天利用PCR技术进行基因类型鉴定(方法见网站http://jaxmice.jax.org)。将产生的Cx43+/-和Cx43+/+小鼠作为研究对象，选择8～10周龄的雄性小鼠。均在无菌条件(specific pathogen free，SPF)下饲养。
       1.2 试剂牛Ⅱ型胶原蛋白(collagen Ⅱ，CⅡ)、完全弗氏佐剂(complete Freund"s adjuvant，CFA)购自美国Chondrex公司，TNF-α试剂盒购自深圳晶美公司。
       1.3 仪器酶标仪ELX800型，Bio-tek，美国产。
       2 方法
       2.1 CIA小鼠模型的制备液态的CⅡ与CFA等体积混合，充分乳化，对Cx43+/-和Cx43+/+小鼠进行造模。首次免疫在小鼠尾部距尾基部2～3cm处皮内注射0.1ml乳剂(含0.1mg CⅡ和0.25mg结核分枝杆菌)，第21天在小鼠尾基部按上述方法加强免疫。对照组用CFA与冰醋酸等体积混合，充分乳化后进行免疫(剂量、方法同实验组)。
       2.2 分组未造模的Cx43+/+和Cx43+/-小鼠分别设为A、B对照组，将造模成功的Cx43+/+小鼠按随机分配的原则分为C、E 组;将造模成功的Cx43+/-小鼠按随机原则分为D、F组。具体分组情况如下：A组：Cx43+/+对照组;B组：Cx43+/-对照组;C组：Cx43+/+ CIA未治疗组;D组：Cx43+/- CIA未治疗组;E组：Cx43+/+ CIA针刺治疗组;F组：Cx43+/- CIA针刺治疗组。每组各4只小鼠。
       2.3 针刺治疗方法针刺组小鼠以自制布袋固定，选取双侧足三里(后三里)穴(膝关节下外侧，腓骨小头下3.5mm处)，直刺3mm。E、F组治疗从首次免疫后第4周开始，1次/d，连续3周，共21次。
       2.4 关节炎评分首次免疫后18d 每天观察小鼠成模情况，并根据肉眼所见的关节炎严重程度进行临床评分，各关节病变程度按4分评分法(详见Chondrex公司)：0分，关节正常;1分，轻度关节肿胀伴或不伴红斑，无关节变形;2分，明显关节肿胀，但无关节变形;3分，关节强直或变形。四肢合计最高评分为12分。
       2.5 TNF-α的测定在针刺治疗后3周眶静脉取血，离心取血清，置-80℃冰箱保存备用。采用ELISA试剂盒，并按试剂盒说明进行检测。结果采用CurveExpert 1.38作标准曲线并计算浓度。
       2.6 统计学处理计量指标均采用±s表示，各组间比较用SPSS 11.0统计学软件包进行分析。
       3 结果
       3.1 针刺治疗对CIA小鼠关节炎指数的影响见表1。表1 各组小鼠不同时期关节炎指数
       牛Ⅱ型胶原免疫的小鼠，初次免疫后3周左右开始出现关节炎症状，即鼠爪明显红、肿，关节炎指数增加，说明CIA造模成功。Cx43+/+ CIA小鼠经针刺治疗3周后，与Cx43+/+ CIA未治疗组相比，关节炎指数明显降低(P<0.01);而Cx43+/- CIA小鼠经针刺治疗3周后，与Cx43+/- CIA未治疗组相比，关节炎指数无明显变化(P>0.05)。
       3.2 血清TNF-α测定见表2。　表2 血清TNF-α测定将各组动物的血清用ELISA法检测TNF-α的含量。结果显示： Cx43+/+ CIA小鼠经针刺治疗3 周后，与未治疗组相比，TNF-α的含量明显降低(P<0.01);而Cx43+/- CIA小鼠经针刺治疗3周后，与未治疗组相比，TNF-α的含量无明显变化(P>0.05)。
       4 讨论
       类风湿关节炎(RA)是一种典型的多因素诱发的自身免疫反应性疾病，T细胞的活化是RA炎症启动与持续的核心事件[5，6]。根据T淋巴细胞分泌细胞因子模式的不同，激活的C辅助T细胞(Th细胞)可分化为Th1和Th2细胞亚群，其中Th1主要分泌IFN-γ，IL-2，IL-1，IL-12，TNF-α;Th2主要分泌IL-4，IL-5，IL-6，IL-10。近年研究提示CIA和RA都是Th1细胞介导的自身免疫应答疾病，某些Th1型炎症型细胞因子(TNF-α)的过度表达，被认为在RA的发病中起重要作用[7，8]。RA的发病机制及病程进展与细胞因子的网络失调关系密切，尤其是TNF-α，它能够启动和维持RA炎症免疫反应。单核-巨噬细胞系大量合成TNF-α，TNF-α又大量诱生其它的体液因子，从而使炎症放大并持续。此外，TNF-α还可激活炎性细胞杀灭微生物，应用TNF中和抗体的小鼠大大降低了对微生物局部感染的控制能力，因而TNF-α被认为是RA发病中首先动员的炎症因子，是激起机体级联反应过程中的关键因子[9]。
       目前抗风湿药或因疗效不十分满意，或因毒副作用太大，难以长期坚持使用。实验研究和临床研究均显示针灸能调节RA患者和模型动物的免疫和内分泌功能、改善血循环等[1]。针灸疗法已越来越广泛用来治疗本病。在本实验中对于CIA小鼠采用了关节炎指数来评估疗效，并检测血清中TNF-α中含量探讨其作用机制。结果显示，针刺治疗Cx43+/+ CIA小鼠关节炎指数和血清中TNF-α含量均比Cx43+/+ CIA小鼠未治疗组下降明显(P<0.01);而Cx43+/- CIA小鼠治疗组与未治疗组比较关节炎指数和血清中TNF-α含量均无明显变化(P>0.05)。TNF-α属于Th1型细胞因子，Th1型细胞分泌的TNF-α等能激活巨噬细胞、成纤维细胞等与RA相关的细胞，而这些细胞又可分泌大量的Th1型细胞因子，在RA病变滑膜的炎症反应中起着重要作用。有研究表明，RA滑膜中的T细胞可表达CD69等活化标志，而激活的T细胞则可通过接触依赖的方式，诱导巨噬细胞和滑膜细胞前炎症性细胞因子(特别是TNF-α)的产生，并由此推动RA病情的发展[10]。所以，抑制Th1型细胞因子的过度分泌，有可能有助于减轻RA滑膜病变早期的炎症反应及滑膜细胞的增生。
       综上所述，与Cx43+/+ CIA小鼠相比，针刺治疗Cx43+/- CIA小鼠疗效不明显，其疗效差异可能是由于针刺对Cx43+/+ CIA小鼠治疗作用是通过缝隙连接蛋白起作用，对Th1型细胞因子TNF-α释放的抑制作用明显，而针刺对Cx43+/- CIA小鼠TNF-α释放的抑制作用不明显，在分子水平上说明了针刺疗效产生与Cx43有关。
       【参考文献】
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