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       【摘要】 
       目的研究珍稀药用金钗石斛DNA指纹图谱，初步探讨直接扩增长度多态性(DALP)分子标记技术在石斛组织培养过程中遗传稳定性检测上的应用。方法采用直接扩增长度多态性(DALP)技术对金钗石斛野生移栽苗和组培苗进行基因组DNA多态性分析。结果从12对引物组合中筛选出6对能获清晰条带的引物组合，分别利用琼脂糖和聚丙烯酰胺对DALP-PCR产物进行凝胶电泳，发现两组苗扩增的DNA带型基本一致，未发现明显变异，说明金钗石斛茎尖离体继代培养具有较高的遗传稳定性。结论DALP分子标记技术可用于石斛遗传稳定性和遗传多样性研究。
       【关键词】  金钗石斛; 组培苗; 直接扩增长度多态性; 遗传稳定性; 指纹图谱
       DALP Analysis of Genetic Stability of Dendrobium nobile Tissue Culture Seedling
       LI Biao1,2, TANG Kun1, ZHU Xiangxian1
       (1. College of Bioinformation, Chongqing University of Posts & Telecommunications, Chongqing 400065，China; 2. Center of Biotechnology, Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100193，China)
       Abstract：ObjectiveTo study DNA fingerprint of Dendrobium nobile and application of direct amplification of length polymorphism (DALP) to the identification of genetic stability on the course of tissue culture. MethodsThe polymorphism of transplanting wild seedlings and tissue culture seedlings from D. nobile were detected by DALP technique. ResultsSix pairs of primer combinations screened from 12 pairs of primer combinations might amplify clear bands. By agarose and polyacrylamide gel electrophoresising, respectively, the DNA bandtypes of DALP-PCR products were basic consistent and the obvious variation were not shown. It indicated that the genetic stability was high on the in vitro shoot tip subculture of D. nobile. ConclusionDALP molecular marker technology can be used for the research of the genetic stability and genetic diversity on Dendrobium.
       Key words：Dendrobium nobile; Tissue culture seedling; DALP; Genetic stability; Fingerprinting
       金钗石斛Dendrobium nobile Lindi.为兰科石斛属多年生附生草本植物，《本草纲目》认为其能“强阴益精，厚肠胃，壮筋骨，暖水脏，补肾益力，轻身延年”等，是药用范围较广的名贵中药[1]。现代药理研究表明，石斛还具有抗肿瘤、抗衰老、增强机体免疫力、扩张血管及抗血小板凝集等作用[2]。金钗石斛药材供应长期依赖野生资源，目前的需求量还在不断增加，野生资源已濒于枯竭状态[3]，因此开展金钗石斛的组培快繁研究对其产业化生产具有决定性的意义和作用。目前，尽管金钗石斛的组织培养已获成功[4]，但对其组织离体继代培养的遗传稳定性研究还未见报道。
       本文采用直接扩增长度多态性(Direct Amplification of Length Polymorphism，DALP)技术对金钗石斛野生移栽苗和组培苗进行基因组DNA指纹图谱分析，初步探讨DALP分子标记技术在石斛组织培养过程中遗传稳定性检测上的应用，为人工繁殖促其产业化生产提供技术支撑。
       1 材料
       试材为从云南潞西2004-10采集的金钗石斛(Dendrobium nobile Lindle)野生株系，栽种在重庆市中药研究院药植园内，同年取其茎尖进行愈伤诱导培养，得其无菌苗的多年继代组培苗。分别以引种的野生栽培苗和继代组培苗的新鲜叶片为实验材料。
       2 方法
       2.1 组织培养取消毒后的金钗石斛野生苗茎尖作为外植体依次分别接种在培养基①MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+2.0%蔗糖，②MS+0.2 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IBA+ 0.05 mg/LNAA+2.0%蔗糖和③1/2 MS + 0.1～0.5 mg/L IBA + 0.5～2.0 mg/L NAA(含椰汁和香蕉提取物)上进行诱导、增殖和生根培养。
       2.2 DALP检测
       2.2.1 DNA提取采用改良的CTAB法提取基因组DNA[5]，每种取0.3～0.5 g新鲜叶片。
       2.2.2 DALP扩增从每种样品中各取1份DNA样品进行预备实验，选出6组能获得清晰条带、反应稳定的随机引物组合：P1P3、P1P4、P2P3、P2P4、P1P5和P2P5，引物名称和序列见表1。表1 本研究中DALP引物组序号与序列
       反应体系：采用20 μl反应体系，其中模板DNA70～80 ng，2.5 μl 25 mmol/L MgCl2，2 μl 10×Buffer，2 μl 2.5 mmol/L dNTPs(总的dNTP为10 mmol/L)，0.5 μl 5U/μl Taq酶，3 μl 5 μmol/L选择性引物，1μl 5 μmol/L反向引物(北京鼎国合成)。对照中的DNA模板用去离子水代替，其余成分皆同。
       扩增仪为Eppendorf梯度扩增仪，扩增程序为：95 ℃预变性5 min，然后先进行12个循环：94 ℃变性30 s，55 ℃复性30 s，72 ℃延伸1 min，该循环复性温度为0.5 ℃梯度降温;然后再进行18个循环：94 ℃变性30 s，50 ℃复性30 s，72 ℃延伸1 min;最后，72 ℃延伸10 min。
       2.3 凝胶电泳检测各取5 μl扩增产物先在1%琼脂糖凝胶电泳，电泳缓冲液1×TAE，Bio-Rad凝胶成像系统，检测DALP带型;再各取5 μl PCR扩增产物进行5%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，250 V恒压电泳4 h，银染干胶后拍照。
       3 结果
       3.1 DNA的提取使用改良的CTAB法提取金钗石斛组培苗和野生苗的基因组DNA，取极少量的叶片就可以获得满足分子标记筛选所需的基因组DNA。而且，金钗石斛组培苗叶片提取基因组DNA的得率普遍高于野生苗，原因可能是组培苗正处生长较旺盛阶段，比其野生苗叶片基因组DNA含量更为丰富。
       3.2 DALP-PCR的建立和引物组合的筛选根据文献资料[6，7]，通过对DALP-PCR反应体系中引物浓度、上下游引物量的比例和不同的退火温度等几个条件的摸索，得到了扩增金钗石斛基因组DNA最佳DALP-PCR反应体系和扩增程序，分别为：采用20 μl反应体系，其中模板DNA70～80 ng，2.5 μl 25 mmol/L MgCl2，2 μl 10×Buffer，2 μl 2.5 mmol/L dNTPs(总的dNTP为10 mmol/L)，0.5 μl 5U/μl Taq酶，3 μl 5 μmol/L选择性引物，1μl 5μmol/L反向引物;扩增程序95 ℃预变性5 min，然后先进行12个循环：94 ℃变性30 s，55 ℃复性30 s，72 ℃延伸1 min，该循环复性温度为0.5 ℃梯度降温;然后再进行18个循环：94 ℃变性30 s，50 ℃复性30 s，72 ℃延伸1 min;最后，72 ℃延伸10 min。利用DALP引物在金钗石斛基因组DNA中进行扩增，从2对反向引物和6对随机引物共12对引物组合中筛选出6对能稳定显示条带的引物组合。
       3.3 金钗石斛组培苗和野生苗DALP分子多态性比较 利用以上6对引物组合分别从金钗石斛野生苗和组培苗的基因组中扩增的DNA带型检测来看，琼脂糖凝胶电泳(见图1)和聚丙烯酰胺凝胶电泳(见图2)显示的各引物对扩增出的条带数，野生苗和组培苗基本一致，未发现明显变异出现，说明金钗石斛茎尖离体继代培养具有较高的遗传稳定性，组培快繁方法适合于金钗石斛大规模培养和繁殖。鉴于聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖凝胶电泳有更灵敏的分辨率，同样的扩增产物，利用聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖凝胶电泳各引物对显示的条带数要多。利用P1P3，P1P4，P2P3，P2P4，P1P5，P2P5引物对在1%的琼脂糖中分别显示出6，2，4，5，4，4条DNA条带，共25条，平均一对引物扩增4.16条带;而在5%非变性聚丙烯酰胺中则分别显示出9，2，8，15，8，8条DNA条带，共50条，平均一对引物扩增8.33条带。见表2。
       1,2,3,4,5,6为野生苗,1",2",3",4",5",6"为组培苗：泳道
       1和1",2和2"、3和3’4和4"、5和5’，6和6"分别为P1P3,P2P3,
       P1P4,P2P4,P1P5,P2P5引物组合：M为DNA Marker(DL2000);
       λ为λ-HindⅢ Fragment;CK为阴性空白对照
       图1 金钗石斛野生苗和组培苗DALP扩增产物1%琼脂糖凝胶电泳
       1,2,3,4,5,6为野生苗,1",2",3",4",5",6"为组培苗;
       泳道1和1’，2和2",3和3’，4和4",5和5’，6和6"分别
       为为为P1P3，P2P3，P1P4，P2P4，P1P5，P2P5
       引物组合;M为DNA Marker(DL2000)
       图2 金钗石斛野生苗和组培苗DALP
       扩增产物5%聚丙烯酰胺凝胶电泳银染图
       表2 金钗石斛DALP-PCR产物在不同介质电泳显示的条带数
       4 讨论
       DALP分子指纹图谱标记技术是1998年由法国的Desmarsis等[8]发展起来的基于随机引物PCR扩增(AP-PCR)，用于检测基因多态性并对扩增产物直接测序的一种新方法。
       DALP与RAPD类似，也是通过AP-PCR方法扩增出不同长度DNA片段，以检测DNA多态性的一种分子标记技术。但DALP利用了测序引物M13的序列特异性，即其广泛分布于真核、原核细胞基因组中，并且以较高频率出现的特性。其引物较RAPD的随机引物长，一般为22～24 mer，PCR扩增使用较高的复性温度(50～55℃)，扩增片段在高分辨率的测序聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，多态性即以扩增片段的不同长度被检测出来。DALP与AFLP相比，两者的共同点是：正向引物具有共同的5’端核心序列，在3’端加上2～4个选择性碱基，可以达到选择性扩增的目的[8]。在检出多态性水平上，DALP与AFLP不相上下，但DALP技术难度较低，实验室操作相当简单且更加安全，远不如AFLP必须进行2次反应那样繁琐且需要同位素或荧光素标记。在实验结果的稳定性和可靠性方面，DALP不存在AFLP的酶切不完全和接头连接不好的问题，扩增反应1次即可完成，所以DALP结果的稳定性、可靠性、安全性都大为提高[9]。
       在植物组织培养过程中，培养材料的遗传稳定性成为人们极为关注的一个问题，它将直接关系到种质资源的离体保存、离体快繁等在遗传上的忠实性[10]。本实验以金钗石斛的茎尖为材料进行接种继代培养，其接种多代的组培苗与其野生移栽苗通过DALP分子标记检测，在带型上组培苗与野生苗不具有明显差异，只是在带的强弱方面略存一些差别。由于本实验所使用的组培苗是经过几年继代的无菌苗，出现一些谱带的强弱可能是由于继代过程中造成的一定程度的变异，但变异程度相当小。因此，金钗石斛茎尖离体继代培养具有较高的遗传稳定性，适合于规模化培育繁殖。
       【参考文献】
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