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       【摘要】 
       目的探讨高效液相色谱法（HPLC）鉴别中药饮品黄芪与红芪中黄芪甲苷的含量，旨在鉴别药材中用红芪代替黄芪的伪品。方法HPLC法鉴别中药饮品黄芪与红芪中黄芪甲苷的含量，根据测定结果鉴别黄芪与红芪。结果样品的测定结果显示，黄芪药材中含有一定量的黄芪甲苷，而红芪中未见黄芪甲苷的成分。结论HPLC法可有效鉴别中药饮品黄芪与红芪，是制剂质量控制的一种有力手段。
       【关键词】  黄芪；红芪；高效液相色谱
          黄芪，始载于《神农本草经》，被列为上品。李时珍谓：“耆长也。黄耆色黄，为补药之长故名”。苏颂谓：“今河东、陕西州多有之。根二、三尺以来，独茎或作丛生， 枝干去地二、三寸，其叶扶作羊齿状，又如蒺藜苗。七月中黄紫花。其实作荚子，长寸许。八月采根用。其皮折之如绵，谓之绵黄芪”。据考证古代正品黄芪以膜荚黄芪及蒙古黄芪为主。
       黄芪性温，味甘，为常用补气药，具有补气固表、利尿排毒、排脓、敛疮生肌等功效［1］。多年研究表明，黄芪皂苷是黄芪药效物质基础的重要组成之一，在抗衰老、调节免疫功能、保护心肌和大脑缺血等方面具有显著作用。黄芪甲苷是主要有效成分之一，具有抗炎镇痛、降压等重要生理活性［2］。红芪，豆科植物多序岩黄芪的根，通称“晋芪”，主产于甘肃南部地区。表面灰红棕色，栓皮易剥落露出浅黄色的皮部及纤维，质坚硬而致密，难折断，折断面纤维性强，且富粉性，气微而特异，味微甜。显微镜下可见晶鞘纤维，草酸钙棱晶，无石细胞。抗菌、降压作用较黄芪强。本研究采用高效液相色谱法（HPLC）测定中药饮品黄芪与红芪中黄芪甲苷的含量，旨在鉴别药材中用红芪代替黄芪的伪品。
       1  仪器与试药
        Agilen t 1100 高效液相色谱仪，包括：四元泵，在线脱气机，柱温箱；蒸发光散射检测器（美国惠泽）；Sartorius BS 400S-WEI万分之一天平（北京塞多利斯天平有限公司）。乙腈（美国Fisher公司，色谱纯），甲醇、正丁醇、氨试液（AR，均为广州化学试剂厂），水为超纯水。黄芪甲苷（中国药品生物制品检定所，批号：07812200311，供定量测定用）。黄芪与红芪均采用中药饮品。
       2  方法与结果
       2.1  黄芪及红芪的一般鉴别
       2.1.1  黄芪性状鉴别：根呈圆柱形，少有分枝，上粗下细，长约8～10cm ，直径1～3.5cm。表皮灰黄色或淡棕褐色，有纵皱纹及横向皮孔。质地硬，略韧，断面纤维性，并显粉性。横断面的皮部黄白色，木部淡黄色，有菊花心，显放射状纹理及裂隙。气微，味微甜，有豆腥味。显微鉴别：①根横切面　木栓层细胞数列，栓内层为厚角细胞，切向延长。韧皮部有纤维束，与筛管群交替排列；近栓内层处有时可见石细胞及管状木栓组织；韧皮射线外侧弯曲有裂隙。形成层成环；木质部导管单个或者2～3个成群，有木纤维束，木射线明显，薄壁细胞含淀粉粒。②粉末为淡黄色，韧皮纤维细长，木纤维长而壁厚，导管为网纹或具缘纹孔，木栓细胞为多角形，棕色，石细胞较少，长方形、类圆形或不规则状，壁甚厚，淀粉粒多为单粒，类圆形，偶有2～3粒组成复粒。理化鉴别：①本品粉末3 g，加水30 ml，浸渍过夜，滤过，取滤液1ml，加0.2%茚三酮溶液2滴，在沸水中加热5 min，冷后呈紫红色 (检查氨基酸、多肽) 。②取以上溶液1ml，于60℃水浴中加热10 min，加入5 % α- 萘酚乙醇溶液5滴，摇匀，沿管壁缓缓加入浓硫酸0.5 ml，在试液与硫酸交界处出现紫红色环(检查糖、多糖)。
       2.1.2  红芪红芪为豆科植物多序岩黄芪的干燥根，表面红棕色或灰棕色，上端略粗，皮部黄白色，约占断面的1/3，木质部黄棕色或淡黄棕色，形成层环浅棕色，质坚硬而较致密，不易折断，折断面纤维状，显菊花心，富粉性，嚼之有豆腥气，栓皮易脱落而露出淡黄色的皮部及纤维。
       2.2  HPLC鉴别
       2.2.1  色谱条件色谱柱为Hypersil ODS（200 mm×416 mm，5 μm）SN：1514654； 流动相为乙腈-水（32∶68）；体积流量110 ml/min；柱温：25℃；ELSD参数：蒸发温度：45℃，N2压力：179260 Pa；衰减参数：理论塔板数以黄芪甲苷计算不低于4 000。见图1。
       2.2.2  标准曲线与线性关系精密称取黄芪甲苷对照品5.00 mg 置10mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得0.5 mg/ml的黄芪甲苷对照品溶液，精密吸取对照品溶液4，8，12，16，20 μl进样，测定，以对照品溶液质量浓度的自然对数为横坐标（X），峰面积的自然对数为纵坐标（Y）绘制标准曲线，计算回归方程为Y=1.294×10-6X+0.027 48，r=0.999 6，黄芪甲苷在2.024～10.120μg 的线性关系良好。
       2.2.3  供试品溶液的制备精密称取黄芪粉末（过40目筛）4.0 g，置60 ml索氏提取器中，加40ml甲醇冷浸过夜，再加30 ml甲醇，80℃水浴回流4h［3］，提取液回收并浓缩至干，残渣加10 ml水，微热使溶解，用水饱和正丁醇振摇提取4次（4×40   ml），合并正丁醇液，用40 ml氨试液充分洗涤2次，每次40 ml，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加5 ml水使溶液，通过D101型大孔吸附树脂柱（内径1.5 cm，长12 cm），以水50ml洗脱，弃去水液，再用40%乙醇30ml洗脱，弃去洗脱液，继用70%乙醇80 ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，用甲醇溶解并定容至5 ml量瓶中，摇匀，即得。
       2.2.4  精密度实验取黄芪甲苷对照品溶液，在1 d之内连续进样5次，20μl/次，计算峰面积RSD为1.3%（n= 5）。
       2.2.5  稳定性实验取所制备的黄芪样品溶液，分别在0，3，6，12，18，24，36，48h测定黄芪甲苷的峰面积，计算黄芪甲苷峰面积的RSD为1.24%。结果表明，供试品溶液在48 h内稳定。
       2.2.6  重复性实验精密称取同一批黄芪药材5份，各约4.0 g，制备供试品溶液，进样分析，测定相应的峰面积，计算黄芪甲苷平均质量分数为1.57 mg/g，RSD=1.26%（n= 5），表明方法的重复性良好。
       2.2.7  回收率实验精密称定已测定的药材中粉6份，各约2.0g，分别精密加入黄芪甲苷3.0mg，按药材供试品溶液制备项下操作，计算回收率，平均回收率为98.0%，RSD为0.87%。
       2.2.8  样品的测定分别取黄芪、红芪，按照“2.2.3”项下方法操作，得供试品溶液，分别精密吸取供试品溶液10μl，按照上述色谱条件分析测定，以外标两点法计算，样品的测定结果显示，黄芪药材中含有一定量的黄芪甲苷，而红芪中未见黄芪甲苷的成分。
       3  讨论
        黄芪为常用补气药，是我国重要的传统药材。《中国药典》规定，药用黄芪为豆科植物蒙古黄芪A stragalus membranaceus ( Fisch.) Bunge var lnong holicus (Bunge) Hsiao 及膜荚黄芪A. membranaceus (Fisch.) Bunge 的干燥根。黄芪中含有多种化学成分，如皂苷类、黄酮类、木脂素类、氨基酸类、多糖类及多种微量元素等［4］。研究表明黄芪甲苷具有降血压、镇静、镇痛及抗氧化等作用［5～7］，是黄芪的主要活性成分，因此黄芪甲苷常作为指标性成分应用于黄芪药材的质量监控。
        目前黄芪甲苷的测定主要采用薄层扫描法，如2000年版《中国药典》收载黄芪药材中黄芪甲苷的测定方法即为TLCS 法，但其操作繁琐，重现性差。黄芪甲苷最大紫外吸收波长Kmax=20 018 nm，为末端吸收，不适于应用紫外吸收检测器测定。蒸发光散射检测器(ELSD) 作为HPLC法的一种检测器，对无紫外吸收的物质较为适用，因此， 参照高效液相色谱法(［1］) ， 经对比文献报道的黄芪甲苷测定方法，并经过反复优化，建立了黄芪甲苷的高效液相-蒸发光散射法测定方法。经过对线性范围、精密度、供试品溶液稳定性、重复性、回收率等方法学考察，证明本方法操作简便、准确可行。采用HPLC法测定黄芪甲苷方法简便快捷，灵敏度高，可以准确地测定黄芪甲苷的含量。
        对黄芪甲苷进行测定时， 提取液以氨试液洗涤的量远高于未用氨试液处理， 据文献报道［8］，黄芪中有5种黄芪皂苷，它们的基本母核均为黄芪皂苷(黄芪甲苷)，这几种皂苷的糖链上连结有1～3个乙酰基，用碱处理时，乙酰基易脱落成为黄芪甲苷。因此经氨试液处理后的样品，所测得结果应该是黄芪总皂苷的量。通过高效液相色谱-蒸发光散射法对不同产地黄芪中黄芪甲苷的测定，对黄芪质量进行比较，得出如下结论: 不同产地黄芪中黄芪甲苷的量有一定差异。
        黄芪甲苷(Astragaloside Ⅳ)是中药黄芪中的特征性成分，目前黄芪药材以及含黄芪的单方及复方中药制剂大多以黄芪甲苷为质量评价指标，由于黄芪甲苷只在紫外末端有吸收，以往文献报道以薄层扫描方法居多，近年来，通过HPLC方法测定黄芪甲苷以其在准确性、重复性、灵敏度等方面的优势而逐渐为人们广泛使用。本研究采用HPLC法测定中药饮品黄芪与红芪中黄芪甲苷的含量，旨在鉴别已成药材中用红芪代替黄芪的伪品。HPLC分析速度快，方法比较简单，重复性好，是制剂质量控制的一种有力手段。饮片经炮制处理， 含水量较高， 含量偏低是否在加工中造成成分损失之故， 有待进一步探讨。
       【参考文献】
         　　［1］国家药典委员会.中国药典［S］.北京：化学工业出版社，2005: 212，附录Ⅳ.
       
       ［2］侯金凤.黄芪的现代药理研究及临床应用［J］.安徽医药，2003，7(3):232.
       
       ［3］Gao Y,Li X,Zhu ZY, et al. Study on enrichment and purification of astragalosides IV from Radix Astragali with macroporous resins［J］.Acad J Sec Mil Med Univ,2006,27(3):334.
       
       ［4］Li L,Tao H Y,Chen J B, et al. Anti-apoptosis effect of astragaloside on adriamycin induced rat"s cardiotoxicity［J］.Chin J Integr Med,2006,26(11):101l.
       
       ［5］Zheng P L,DAI J Y,Chen H,et a1.Influence of astragaloside IV(ASIV)on systolic and diastolic function in dogs with acute heart failure［J］.Chin Pharmacol Bull,2005,21(2):1534.
       
       ［6］Li H B,GeY K,Le Z, et al. Astragaloside IV improved barrier dysfunction induced by acute high glucose in human umbilical vein endothelial cells ［J］.Life Sci,2006,79(12):1186.
       
       ［7］王 洋，陈 涛，李 进.黄芪药材指纹图谱的研究进展［J］.时珍国医国药,2007,18(11):2718.
       
       ［8］原田正敏，姜顺善.日本常用生药的定量方法：黄芪［J］.国外医药·植物药分册，1990，5（5）：201.