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       【关键词】  半边旗；,,水溶性成分；,,抗肿瘤
       摘要：目的研究半边旗水溶性成分对不同肿瘤细胞生长的抑制作用。方法采用MTT法及 Trypan Blue拒染法。结果半边旗水溶性成分对求BEL-7402，A549，K562细胞生长的抑制率达到56.39%，53.85%，74.70%。结论半边旗水溶性成分对多种肿瘤细胞的生长具有明显的抑制作用。
       关键词：半边旗；  水溶性成分；  抗肿瘤
       Studies on the Antitumor Effects of Soluble Components of Pteris . semipnnata L. against Various Tumor Cells
       LIU Yi, GONG Xianling, LIANG Nianci
       (Guangdong Key Laboratory for Research and Development of Natural Drugs, Guangdong Medical College, Zhanjiang, Guangdong 524023,China)
       Abstract：ObjectiveTo study the antitumor effects of the soluble components of Pteris  semipnnata L. (PsL)on various tumor cells. MethodsCell grow inhibition mediated by the soluble components of PsL was measured by MTT assay and Trypan Blue　exclusion. ResultsThe effects of the soluble components of PsL on growth of BEL-7402, A549,K562 cells after 24 hours treatment were 56.39%、53.85%、74.70%, respectively. ConclusionThe soluble components of PsL can significantly inhibit the growth of various tumor cells.
       Key words：Pteris semipnnata L;   Soluble components;  Antitumor
   
　　半边旗Pteris semipnnata L. (PsL）是一种民间草药，属凤尾蕨科植物，性寒，具疏解风寒、化湿消味、消热解毒的功效。近年来我实验室的研究表明半边旗具有显著的体内外抗肿瘤作用［1~3］，对其作用机理也已作了不少的研究［4，5］。分离、纯化后得到的抗肿瘤活性成分为二萜类化合物5 F，6 F，A。其中5 F能将肿瘤细胞的细胞周期阻滞在 G2/M期并能导致其凋亡，但对其经过 CO2超临界萃取提走以上二萜类化合物后所得残渣中的水溶性成分（SCPsL）的抗肿瘤活性研究还未见有相关报道。本研究实验包括半边旗水溶性成分的提取、体外抗肿瘤作用的初步筛选及对不同肿瘤细胞生长抑制作用的比较。
       　　1   材料与方法
       1.1   材料MTT、Trypan Blue购自 Sigma公司；超级无支原体新生牛血清购自杭州四季青生物材料有限公司；RPMI-1640购自美国 Hyclone公司；胰酶购自美国 Gibco公司；其余试剂均为国产分析纯。人肝癌 BLE-7402细胞、人肺腺癌 A549细胞、人慢性粒细胞白血病细胞 K562细胞由本室传代。
       1.2   方法
       1.2.1   半边旗水溶性成分的提取经 CO2超临界萃取后半边旗残渣5 g，加10倍量95% 乙醇水浴回流，微沸1h，滤纸过滤，收集滤液；将滤渣再加10倍量95%乙醇，水浴回流微沸1 h，滤纸过滤，得滤液。合并两次所得滤液，回收乙醇得浸膏，加50ml三蒸水，离心10min（2000 r/min），取上清，制成浓度为100 mg生药・ml-1的溶液，过滤除菌备用。
       1.2.2  细胞培养 BLE-7402，A549，K562细胞培养于含10%小牛血清，100 kU・L-1青霉素和100 mg・L-1链霉素的 RPMI-1640培养液中，37℃、5% CO2饱和湿度细胞培养箱培养。取对数生长期细胞用于实验。
       1.2.3   MTT法［6］取对数生长期的期 BLE7402，A549细胞，用0.25%胰蛋白酶消化，RPMI-1640完全培养液调制成5.0×104个・ml-1细胞悬液，接种于96孔板中，每孔接种100 μl（含5.0×103个细胞）。培养过夜后，吸出培养液，加入新培养液90 μl及不同浓度的半边旗水溶性成分溶液10 μl，使终浓度分别为1.25，1.75，2.50，5.00 mg生药・ml-1。同时设置空白及5-Fu阳性对照孔，对照组则加入相同体积的培养液，每一浓度设8个平行孔。继续培养24 h。每孔加入MTT(5 g・L-1)20 μl，继续培养4~6 h。每孔加入 DMSO 100 μl。在微型振荡器上摇匀15 min，结晶溶解后，立即比色，用 ELX800型酶标仪在主波长为570 nm，参比波长为630处测量OD值，比色以空白孔调零。抑制率=（1-实验组8孔OD值平均值/对照组8孔OD值平均值）×100%。
       1.2.4  Trypan Blue拒染法选取对数生长期的K562细胞,调整细胞浓度至4.4×105个・ml-1，每孔450 μl接种于24孔板中，使每孔的细胞数为2×105个 。然后，加入不同浓度的受试化合物。每个浓度设3个平行孔，同时设置空白及5―― Fu阳性对照孔。将培养板放入37℃，5%CO2饱和湿度孵箱中继续培养24 h后每孔加入50 μl 0.4%  Trypan Blue溶液染色。镜下计数，检测活细胞数。抑制率=（对照组3孔活细胞数平均值-实验组3孔活细胞数平均值/对照组3孔活细胞数平均值）×100%。
       　　2  结果
       2.1   半边旗水溶性成分对人肺腺癌 BEL-7402细胞生长的抑制作用半边旗水提物作用于人肝癌  BLE-7402细胞24 h，能明显地抑制其增殖，且呈剂量依赖关系。结果见表1。
       表1  半边旗水提物对 BEL-7402细胞生长的抑制作用(略)
       与空白组比较，*** P＜0.001
       2.2  半边旗水溶性成分对人肺腺癌 A549细胞增殖的抑制作用从表2可以看出，半边旗水提物能明显地抑制其增殖，且呈剂量依赖关系。
       表2  半边旗水提物对A549细胞增殖的抑制作用(略)
       与空白组比较，*** P＜0.001
       2.3   半边旗水溶性成分对人慢性粒细胞白血病细胞 K562细胞增殖的抑制作用半边旗水提物作用于人慢性粒细胞白血病细胞 K562细胞24 h，能明显地抑制其增殖，且呈剂量依赖关系。与阳性对照药5――Fu相比，其对 K562细胞的生长抑制作用更为明显和有效。这说明半边旗水提物对某些对药物敏感的肿瘤细胞有着明显的抑制作用。
       表3   半边旗水提物对 K562细胞增殖的抑制作用(略)
       与空白组比较，***P＜0.001
       2.4   半边旗水溶性成分对肝癌 BLE-7402细胞、人肺腺癌 A549细胞、人慢性粒细胞白血病细胞 K562细胞增殖的抑制作用比较从图1可以看出，半边旗水溶性成分对3种人肿瘤细胞都有明显的抑制作用，但对人慢性粒细胞白血病细胞 K562细胞生长的抑制作用更为显著。在5.00 mg生药・ml-1这个浓度下对 BEL7402，A549，K562细胞的增殖抑制作用达到了56.39%，53.85%，74.70%，效果均优级于阳性对照药5――Fu，说明半边旗水溶性成分对不同肿瘤细胞生长有着明显的抑制作用，是一种值得深入研究和有望开发的抗肿瘤活性成分。
       图1  半边旗水溶性成分对BEL-7402，A549，K562细胞增殖的抑制作用比较(略)
       　　3  讨论
       目前，已开发应用于临床的抗肿瘤药物大多数属于化学合成药或微生物代谢产物，且多具有特异选择性差、毒副作用大、效果不理想等不足，而中草药因为毒副作用相对较小、作用原理独特、效果明显，有别于以上两种药物，因此从中草药中提取高效低毒的抗肿瘤药物已成为天然药物研究与开发的重要方向。水溶性成分由于极性大，容易穿透细胞且活性强，已经成为近年来研究的热点。半边旗水溶性成分在体外对肿瘤细胞生长有明显的抑制作用，极有可能被开发成为抗肿瘤新药。半边旗水溶性成分的抗肿瘤研究目前在国内外均未有相关的报道。
       　　参考文献：
       ［1］   崔  燎，梁念慈，陈志东，等．半边旗体内外抗癌急慢性毒性研究［J］.中药材，1996，32（1）：29..
       ［2］  张  晓，崔  燎，梁念慈，等．半边旗有效成分及抗肿瘤活性研究［J］.中国药学杂志，1997，32（1）：37.
       ［3］  李金华，梁念慈，莫丽儿，等．半边旗五种成分体外细胞毒活性比较及构效关系分析［J］．药学学报，1998，33（9）：641.
       ［4］  何承伟，梁念慈，莫丽儿，等．半边旗抗肿瘤有效成分6F对HL-60细胞周期的影响及体外增效作用［J］．癌症，1998，17（7）：191.
       ［5］  李金华，梁念慈，莫丽儿，等．半边旗有效化合物对肺癌细胞DNA拓扑异构，TPK及c-myc基因的影响［J］．中国药理学报，1999，20（6）：541.
       ［6］  Hansen MB,Nielsen SE,Berg K.Re-examination and further development of a precise and rapid dye method for measuring cell growth/cell kill［J］.J Immunol Methods,1989，119:2.
       (广东医学院 广东天然药物研究与开发重点实验室 ，广东 湛江  524023)