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       【摘要】 
       目的研究激素加滋阴清热方治疗前、中、后阴虚内热证红斑狼疮（SLE）外周血单一核细胞（PBMC）基因表达的动态变化。方法阴虚内热证SLE患者治疗前、中、后3次外周血单一核细胞基因谱芯片检测与比较。结果找到治疗前、中、后表达有统计学意义的基因20个。结论激素与滋阴清热方可以上调或下调许多基因的表达，从而调节T、B淋巴细胞的的分化与凋亡，减少补体级联反应等导致的炎症反应，调节机体免疫功能而改善病情。
       【关键词】  阴虚内热证； 红斑狼疮； 基因芯片
       Dynamic Study on PBMC Gene Expression of SLE with Yin Asthenia Generating Intrinsic Heat before, during and after Treatment
       LAI Meisheng, FAN Ruiqiang
       （1. Surgery of TCM, Southern Medical University, Guangzhou, Guangdong,510515, China；2.Dermatology of Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou, Guangdong, 510120,China）
       Abstract：ObjectiveTo study the dynamic gene expression of the mononuclear cells of the heat deficiency patiants with lupus erythematosus (SLE) before, during and after hormone and Ziyin Qingre formula treatment.MethodsBefore, during and after the treatment, peripheral blood mononuclear cells of the SLE patients with yin asthenia generating intrinsic heat were separated,then gene chip method was used to analyze and compare.Results20 genes were found significantly different before, during and after reglcate treatment. ConclusionHormones and Ziyin Qingre formula can up-regucate and down-regulate the expression of many genes, Regulat T, B lymphocyte differentiation and apoptosis, reduce inflammatory response by lightening complement cascade, and regulate the immune function.
       Key words： Yin asthenia generating intrinsic heat;Lupus erythematosus (SLE); Gene chip
       
       红斑狼疮(SLE)是多基因相关的自身免疫性系统性疾病，SLE的发生是由多基因共同作用的结果，在各种致病因素的作用下，多基因的活化或抑制，共同决定了SLE的产生、临床特征及转归。SLE发病中多基因共同作用是明确的，仅观察单一或某一基因家族未能全面地反映机体基因整体的变化，应用基因芯片技术研究SLE基因表达谱的动态变化显得非常必要。前期课题组发现SLE不同证型间存在基因表达的差异［1］，本次我们选择了SLE阴虚内热基本证型患者来进行研究。
       1  研究对象
       轻中度（5≤SLEDAI≤25）阴虚内热证SLE患者从2005-11～2006-11在广东省中医院门诊就诊的女性患者（年龄在18～50岁之间）中纳入，总共纳入18例，其中退出2例，失访1例，有效病例共15例。健康对照组来自于广州中医药大学健康大学生和健康志愿者，共15例。纳入、排除、剔除、退出标准见赖梅生博士论文（滋阴清热方对阴虚内热证SLE淋巴细胞基因及蛋白表达谱的动态影响。广州中医药大学博士学位论文，2007）。
       阴虚内热证SLE患者15例，均为女性，最大48岁，最小18岁，平均年龄（31.60±9.37）；健康对照组15例，均为女性，最大42岁，最小18岁，平均年龄（28.4±6.50）。两组年龄经两样本t检验，方差齐性（F＝2.929，P＝0.098），差异无统计学意义（t=1.087，P=0.289）。
       2  研究方法
       2.1  治疗方法
       2.1.1  滋阴清热方(狼疮Ⅱ号)治疗5粒/次，3次/d，口服。 部分病人阴虚内热证候比较明显时，短期配合使用滋阴清热方汤剂，加强滋阴清热功效。
       2.1.2  一般治疗及对症处理保护胃粘膜、补钾、补钙、抗感染。西医药除激素外，只根据患者激素用量配合使用泰胃美、雷尼替丁保护胃粘膜。
       2.1.3  激素治疗所有病例均维持纳入时的激素用量，最高不超过25 mg。
       2.1.4  疗程疗程一般为3个月。
       2.2  基因芯片实验方法分别于治疗前、治疗中（6周）和治疗后（12周）采静脉血分离提取单一核细胞，然后按基因芯片技术要求提取总RNA，－70℃保存备用，按完成3个月疗程的先后顺序送检9例患者的27个样本和10例正常人样本，其中4例患者至少有一次样本不符合基因芯片实验要求，最后选择了3次样本均合格的5例患者的15个样本及正常对照组10个样本进行基因表达谱实验，具体方法及资料参见赖梅生博士论文（滋阴清热方对阴虚内热证SLE淋巴细胞基因及蛋白表达谱的动态影响。广州中医药大学博士学位论文，2007）。
       2.3  微芯人类基因表达谱芯片人类基因表达谱芯片由微芯生物公司采用cDNA直接点样生产，共点有8064个基因点。详细情况参见赖梅生博士论文（滋阴清热方对阴虚内热证SLE淋巴细胞基因及蛋白表达谱的动态影响。广州中医药大学博士学位论文，2007）。
       2.4  数据处理与统计分析比值（Ratio）表示荧光信号通过LOWESS方法归一化后，基因表达量在实验组（对照组）和对照组（实验组）间的变化倍数（大于1的数值代表相应基因表达量上调的倍数，小于1的数值则代表相应基因表达量下调，其倍数则用1除以该数值后的负数来表示）。按两个样品信号强度间的比值（Ratio）大于2或小于0.5的数据作为表达有显著性差异的基因数据。
       所有数据中至少三次独立实验处理过程中存在明显表达差异的数据共有167个基因，同一基因前、中、后3次表达与正常人的表达的比值（Ratio）取常用对数后，用SPSS13.0软件对同一基因3次表达差异进行统计分析，若方差齐则用ONE-WAY-ANOVA分析，两两比较用Dunnett(2-sided)。
       3  结果
       阴虚内热证SLE患者外周血单一核细胞167个基因中，前、中、后3次表达差异有统计学意义（P<0.05）的有20个基因，结果如图1。
       4  讨论
       人免疫球蛋白K链c区（IGKC）基因，编码免疫球蛋白轻链，广泛参与免疫应答、抗原递呈、抗原加工等免疫过程，是20个基因中唯一一个下调的基因。该基因治疗前高于正常人与SLE患者细胞免疫亢进相一致，而治疗后表达低于正常人，提示中西医综合治疗手段可通过抑制IGKC基因的表达而减少免疫球蛋白的合成，减轻细胞免疫，从而缓解病情。
       ACTR2基因编码肌动蛋白相关蛋白2（Arp2），Arp2和Arp3复合物在真核生物中对控制肌动蛋白动态平衡起核心作用，具有使肌动蛋白聚合和使肌动蛋白纤维尖端加帽及交联肌动蛋白纤维成网状结构的能力。肌动蛋白存在于所有真核细胞中，参与细胞分裂、运动、迁移、形态的维持、生长等多种重要生理活动。肌动蛋白可能参与了大多数RNA聚合酶Ⅱ介导的基因转录活动、 RNA的加工与运输。细胞核中的肌动蛋白，不仅作为一种结构蛋白参与核骨架和染色质骨架的组成，更重要的是作为一种功能蛋白，参与调整染色质结构和调控基因转录活动［2］。王展等［3］的研究认为SLE患者血中脱氧核糖核酸酶1基因（Deoxyribonuclease Ⅰ，DNaseⅠ）活性与肌动蛋白浓度之间呈负相关，提示血中肌动蛋白浓度的增高可能是DNaseⅠ活性降低的原因之一。冯学兵等［4］的研究发现SLE患者 DNASE1 基因表达水平显著高于正常对照(P<0.001)，未发现SLE疾病活动性指数积分与基因表达水平存在相关性，但性别分析显示女性患者DNASE1 基因表达水平高于男性患者(P<0.01)，提示 DNASE1 基因与SLE发病相关。ACTR2表达治疗前低于正常人，治疗后接近正常人，提示SLE患者治疗前Arp2合成低下，中西医治疗可能通过提高Arp2合成以降低DNaseⅠ的活性，减少抗双链脱氧核糖核酸抗体（ds-DNA）的生成而达到改善病情的目的。
       古蛋白1（ARCN1）基因参与细胞内蛋白运输，与热休克蛋白有类似作用，与高尔基内质网膜泡介导运输有关。治疗前接近正常，治疗6周上调，治疗12周又下调，提示ARCN1可能作为辅助因子参与SLE病理过程。
       隐花色素2基因（cryptochrome 2，CRY2)参与DNA的修复，作为不依赖于光照的昼夜节律钟的一个部件，可调节周期同族体1（PER1）转录子的周期循环［5］，而PER1是生理循环的转录因子，作为一种负性调节元件，可发挥转录抑制效应。CRY2是可吸收蓝光(400～500 nm)和近紫外光(320～400 nm)而引起光变态反应的一类光敏受体。治疗后CRY2表达增多，它在红斑狼疮发生与治疗中的作用有待进一步研究。
       补体促衰变因子（DAF，CD55 分子）是一种免疫调节因子，是补体激活途径中的一个重要膜调节蛋白，可通过与C2竞争与C4b结合，从而抑制C3转化酶的形成并促进其分解而调节经典途径或通过竞争性抑制B因子与C3b结合而干扰旁路途径C3转化酶的组装，从而阻断补体级联反应，从而保护自身细胞。DAF在SLE弥漫增生性肾小球肾炎患者中血红细胞和肾小球细胞中高表达，提示对补体介导的损伤起积极的防护作用［6］。本研究中治疗前明显低于正常人，治疗后明显高于正常人，提示中西医综合治疗可能通过上调DAF的表达而对抗由补体介导的损伤。
       二氢嘧啶酶样2（DPYSL2）参与核苷酸和核酸代谢、信号转导、神经系统发育等，可能与其它候补基因相互作用引起精神分裂症［7，8］。本研究中，治疗前接近正常人，治疗后高于正常人，它在SLE发病中的作用有待进一步研究探讨。
       脆性X智力低下基因（FMR1）参与mRNA 加工、运输，有研究认为FMRP缺失可导致树突棘密度增高和感觉皮质功能柱区域树突棘修剪异常。治疗前显著低于正常人，治疗后明显上调而接近正常人，其在SLE发病中的作用有待进一步探讨。
       激活酪氨酸激酶基因（FYN）是经典的src激酶家族成员，在细胞生长，分化和转化的调节中起重要作用。具有核苷酸结合、蛋白酪氨酸激酶、非膜跨越蛋白酪氨酸激酶、蛋白结合等活性，参与蛋白氨基酸磷酸化、钙离子运输、细胞内信号转导级联、蛋白激酶级联、T 细胞受体信号转导途径等。本研究中治疗前低于正常人，治疗后高于正常人，提示FYN可能通过T 细胞受体信号转导等途径参与自身免疫的调节过程。
       趋化因子配体3（GRO3）基因，参与趋化、炎症应答、G 蛋白偶联受体蛋白信号转导途径及应答刺激等。治疗前低于正常人，治疗后显著高于正常人，提示GRO3可能是治疗相关的效应蛋白，它在SLE发病进程中的作用有待进一步深入研究。
       极端同源物(LFNG)基因，编码一种信号传导膜蛋白，可减少JAGGED1与 NOTCH2结合。JAGGED1是Notch信号通路中的一个配体，它能诱导树突状细胞的成熟，并通过促使T淋巴细胞分化成调节性T细胞或Ⅱ型T辅助细胞，从而诱导免疫耐受［9］。本研究中，治疗前LFNG表达接近正常人，治疗后显著上调，提示可能通过上调LFNG的表达而抑制SLE患者T淋巴细胞成熟与分化，从而调节免疫应答。
       NS1-BP基因为流感病毒NS1A结合蛋白(IVNS1ABP)基因。NS1-BP与细胞核剪接体组成相关，参与mRNA前体的剪接过程［10］，治疗前明显低于正常人，治疗后高于正常人，提示治疗可能通过上调NS1-BP的表达，影响淋巴细胞内前mRNA剪接成熟，进而调控基因的表达。
       P125基因，又名sec23ip，编码SEC23 结合蛋白。囊胞分子复合体
       （Sec23/24-Sar1）是COPⅡ衣被小泡的重要组成成分，参与蛋白从内质网转运出来的重要生理过程。P125负责SEC23的结合与固定［11］。在本研究中治疗前显著低于正常人，治疗后高于正常人，提示P125可能参与了SLE的发病进程，治疗可能通过上调P125而增强SEC23蛋白与SEC24蛋白结合与固定形成囊胞分子复合体，改善蛋白的转运有关，有必要进一步研究P125在SLE中表达低下在SLE发病中的作用以及促进P125表达在治疗中的作用。
       前B细胞克隆增强因子（PBEF）表达治疗前低于正常人，治疗后上调接近正常人。PBEF受IL-6 和IL-6相关细胞因子OSM的调节，在关节炎期间表达增高，PBEF可能与关节炎的发病有关［12］，PBEF与SLE的关系有待进一步研究。
       蛋白激酶C-β1(PRKCB1)基因，编码一种在糖尿病相关肾病中起重要作用的信号分子，可以作为预测日本2型糖尿病患者肾病恶化的因子［13］。治疗前PRKCB1表达明显低于正常人，治疗后接近正常人，提示PRKCB1在SLE的发病中可能起着重要作用，是否与狼疮肾的发生与发展有关需进一步研究。
       PSCDBP基因是白介素-12诱导而表达的细胞色素C家族，它可激活树突状细胞并促进其与T细胞的粘附。PSCDBP治疗前接近正常，治疗后上调，其在SLE发病与治疗中的作用有待进一步研究。
       蛋白酪氨酸磷酸酶受体E(PTPRE)基因，参与蛋白氨基酸去磷酸化，对细胞信号传导、细胞生长与分化及免疫应答有重要作用。蛋白酪氨酸磷酸酶受体O（PTPRO）具有维持B细胞静止，抑制其生长及促进其分化的作用［14］。在本研究中治疗前低于正常人，治疗后高于正常人，提示PTPRE可能参与SLE患者淋巴细胞病理过程，SLE的治疗是否通过上调PTPRE来抑制B细胞增殖并促进分化有待进一步研究证实。
       固醇载体蛋白2（SCP2）基因，可能通过增强过氧物酶体多功能酶2（MFE2）与脂酰CoA的结合力，使得MFE2发挥最有效的催化活力，在哺乳类动物的脂类代谢中发挥其重要作用。本研究中，治疗前低于正常人，治疗后高于正常人，中药等综合治疗对该基因的表达有上调作用，但在SLE治疗中的作用仍不明。
       跨膜蛋白2 (TMEM2)基因，治疗后表达显著高于治疗前，提示TMEM2参与到SLE的发病过程，具体作用有待进一步研究以证实。肿瘤坏死因子基因（TNF）。TNF在SLE发病中的作用目前研究不一致。TNF可通过与（肿廇坏死因子受体）TNFR结合而起广泛的生物学活性，如参与炎症反应和免疫应答，同时TNF与TNFR也是重要的死亡配体和死亡受体，两者结合后可诱导细胞凋亡［15］。本研究中发现TNF治疗前低于正常人，治疗后显著高于正常人。可能TNF表达的增高，通过介导过度增生的异常B淋巴细胞的凋亡而起调节自身免疫的功能。TNF在SLE发病中的作用可能是多方位的，一方面它可以介导炎症的发生，引起组织损害，另一方面可通过加速病变细胞的凋亡。治疗可能通过调节两种不同作用起改善病情的作用。
       ZFP103基因为抗抑郁相关基因，是抗抑郁药的新靶点，编码的锌指蛋白在泛肽-蛋白酶体系统起重要作用［16］。ZFP103治疗前表达低于正常人，治疗后高于正常人。这与多数患者中医药干预前表现出的狂躁或精神抑郁以及中医药治疗后患者自觉明显好转相一致，提示滋阴清热方可能通过提高抗抑郁相关基因的表达达到缓解精神神经症状，有待进一步研究证实。
       从以上结果与分析看来，阴虚内热证SLE患者淋巴细胞许多基因治疗前、中、后表达有上调或下调，通过调节T、B淋巴细胞的的分化与凋亡（上调LFNG的表达而抑制SLE患者T淋巴细胞成熟与分化，从而调节免疫应答；上调PTPRE来抑制B细胞增殖并促进分化，以及TNF等因子的的表达来诱导异常增生的B细胞克隆的凋亡），减少补体级联反应（上调DAF的表达）等导致的炎症反应，抑制自身抗体的合成（提高Arp2合成以调节肌动蛋白功能，进而降低DNaseⅠ的活性，减少ds-DNA的生成），调节机体免疫功能等环节来改善病情。这些差异表达基因间的关系非常复杂，还需深入研究这些基因在SLE发病与治疗中所扮演的角色。
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