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       【摘要】 
       目的观察针刺对肥胖大鼠血清胰岛素含量和胰岛组织胰岛素受体底物1，2（IRS-1，IRS-2）表达的影响，探讨针刺对高脂饮食性肥胖大鼠胰岛素抵抗的影响。方法采用实时定量PCR技术测定胰岛素受体底物1，2（IRS-1，IRS-2）基因表达水平, 酶联免疫测定法测定血清中胰岛素的含量，生化比色法测定血清葡萄糖含量。 结果针刺治疗取得良好减肥疗效的同时，肥胖大鼠血清中葡萄糖及胰岛素水平明显回降，而胰岛组织胰岛素受体底物1（IRS-1）基因表达水平却明显升高。结论针刺可改善肥胖大鼠胰岛素信号转导，减轻胰岛素抵抗。
       【关键词】  胰岛素抵抗； 肥胖； 大鼠； 胰岛素受体底物
        肥胖已成为现代生活的流行病，其发病过程复杂,危害严重［1,2］，对肥胖的研究已成为21世纪科学研究的迫切任务。有研究表明肥胖大鼠血中胰岛素（INS）含量异常升高,肥胖机体具有高胰岛素血症，这些结果证明了肥胖机体存在着胰岛素抵抗（IR）［3～5］。本研究应用酶联免疫测定法和实时定量PCR技术观察针刺治疗前后肥胖大鼠血中胰岛素的含量以及胰岛IRS-1和IRS-2基因表达的水平，以探讨针刺对单纯性肥胖致胰岛素抵抗的影响及其可能的作用机制。
       1  材料
       设计：随机对照动物实验。
       时间及地点：实验于2006-10～2007-01在南京中医药大学动物实验中心、江苏省针灸学重点实验室（BSL-3）完成。
       材料：刚断乳的健康清洁级雄性SD大鼠90只，体质量50～70g, 由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供（动物许可证号：SCXK（沪）2003-0002）。仪器和试剂：韩氏LH402A穴位神经电刺激仪，UV-754分光光度计（上海第三分析仪器厂），DG5031酶联免疫检测仪（华东电子管厂），基因扩增仪MJ-mini（BIO-RAD公司），实时定量PCR仪Mx3000P(Stratagene公司)，血清葡萄糖试剂盒（上海荣盛生物技术有限公司），血清胰岛素Elisa试剂盒（批号：ADL原装 96T Elisa），总RNA抽提试剂Trizol（Invitrogen 公司），反转录试剂盒M-MLV（Promega 公司），SYBR Green Ⅰ(Stratagene公司)。
       2  方法
       2.1  单纯性肥胖大鼠模型的制作选用刚断乳的健康清洁级SD雄性大鼠90只,体质量50～70 g, 由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供。参照刘氏提供的实验性肥胖造模方法［6］改进，大鼠适应饲养1周后，随机挑选10只，用普通饲料喂养，称正常组。另一组80只，用由苏州双狮实验动物饲料有限公司提供的高脂致肥饲料喂养，称高脂组，分组时两组大鼠体重无差异。以体重超过普通饲料组10%为肥胖标准，4个月后，造模成功30只。
       2.2  动物分组造模后，将获得的肥胖大鼠30只随机分为肥胖模型组和针刺
       组，每组各15只。
       2.3  治疗方法针刺组：将大鼠捆绑于自制的固定器中，用环球牌32号无菌针灸针针刺一侧“足三里”穴和“内庭”穴，左右侧隔日交替轮换取穴。施平补平泻手法后，“足三里”穴、“中脘”穴连接韩氏LH402A穴位神经电刺激仪，频率2/15 Hz，强度2mA，治疗时间15 min/d，每6 d休息1 d，共观察39 d，治疗或束缚33次。治疗或束缚期间所有大鼠均普通饲料自由饮食。模型组：将大鼠捆绑于自制的固定器中，捆绑时间同针刺组，余不作处理。
       2.4  标本提取各组大鼠实验期间均采用普通全价鼠饲料喂养,自由摄食和饮水,每日更换饲料和水。实验前后观察大鼠摄食量、饮水量、体质量、体长及Leeps 指数等。实验结束后,禁食过夜,次日眼球采血，2 000 r/min离心20 min，分离血清，-20℃保存待测。断头处死,迅速分离出胰岛置于液氮中保存。
       2.5  生化比色法测定血清葡萄糖试剂盒（上海荣盛生物技术有限公司），所有测定步骤和计算公式均严格按照试剂盒说明书操作。胰岛素敏感指数（IAI）=1/（空腹胰岛素×空腹葡萄糖）
       2.6  ELISA法测定胰岛素血清胰岛素（INS）检测药盒由上海天呈生物信息科技有限公司代理进口（批号：ADL原装 96T Elisa）。用酶联免疫法，测定相应光密度，根据标准曲线计算出胰岛素的浓度，数据以ng·ml-1来表示。所有测定步骤和计算公式均严格按照试剂盒说明书操作。
       2.7  SYBR Green实时定量PCR检测
       2.7.1  总RNA制备胰岛组织100～200 mg，分别加入1 ml Trizol ,按试剂说明书中操作步骤进行RNA提取。使用Eppendorf公司的核酸蛋白测定仪检测抽提总RNA 的质量和浓度。要求A260/ A280比值约2. 0，并计算RNA含量。
       2.7.2  cDNA合成反应体系20 μl。取5 ×反应缓冲液4 μl，dNTP（10 mmol/ L）2 μl，Oligo-dT（25 μmol/L）1 μl，RNAsin 40 U，MMLV(10 U/μl) 1 μl，每一标本取总RNA 2 μg，加无RNA 酶水至20 μl。42 ℃ 60 min，70 ℃10 min 进行逆转录。合成好的cDNA 置- 70 ℃保存备用。
       2.7.3  引物RS1基因和IRS2基因使用引物设计软件primer 5.0，分别参照GeneBank 序列号NM_012969，XM_573948 跨内含子设计，上海Sangon 合成。IRS1上游引物: 5"  ATG TCG CCA GTG GGA GAT T  3",下游引物：5"  CTT CGG CAG TTG CGG TAT A  3" 。IRS2上游引物: 5"  CAC TTG AAA GAA GCC ACC G  3",下游引物: 5"  TGT ACT CCA TCA GCC CGT TA  3" 。β-actin 作内对照。
       2.7.4  SYBR Green Ⅰ实时定量PCR20μl的反应体系中包括:水7 μl ,上下游引物各0. 5 μl (10 μmol)，Mix SYBR Green 10 μl (包括反应缓冲液, dNTP ,10 mmol/ L MgCl2 SYBR Green Fast Start DNA Taq 酶) ，cDNA 标本2 μl。反应体系加入实时定量PCR仪Mx 3000P(Stratagene公司)进行PCR 扩增。反应条件为95 ℃ 10 min，95 ℃ 30 s，52 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s 。设置温度改变速率均为20℃/ s ,循环40 次。将检测的临界点设定在PCR 扩增过程中,荧光信号由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环数(threshold cycle , Ct) 值处。
       2.8  主要观察指标①针刺对肥胖大鼠体质量的影响。②针刺对肥胖大鼠血清血糖，胰岛素及胰岛素敏感指数含量的影响。③针刺对肥胖大鼠胰脏IRS-1与IRS-2的mRNA水平的影响。
       2.9  设计、实施、评估者分别为第1，第2，3，4作者，第1作者，受过动物饲养及相关实验的培训。
       2.10  统计学方法由第3作者以SPSS13.0统计软件的单向方差分析进行多样本均数比较和均数间比较，以双变量相关分析进行各因素关系的分析，统计量以±s 表示。
       3  结果
       3.1  实验动物数量分析正常组SD大鼠10只，造模后获得的肥胖大鼠30只，没有脱失，全部进入结果分析。
       3.2  针刺对肥胖大鼠体质量的影响结果见表1。表1  实验各组体质量的比较（略）
       表1可见，肥胖大鼠体质量显著高于正常大鼠水平（P<0.01），针刺治疗后，体质量显著回降（P<0.01），经统计学处理差异具有非常显著性意义。
       3.3  针刺对肥胖大鼠血清血糖，胰岛素及胰岛素敏感指数的影响见表2。表2  实验各组血糖、胰岛素及胰岛素敏感指数的影响(略)
       表2可见,模型组血清空腹血糖与胰岛素含量较正常组明显升高（P<0.01），针刺组血清空腹血糖与胰岛素含量较明显回降（P<0.01），经统计学处理差异均具有显著性意义。
       模型组IAI较正常组模型组与正常组差异无统计学意义 （P=0.268），针刺组的胰岛素敏感指数与模型组相比，差异具有统计学意义（P=0.039）
       3.4  针刺对肥胖大鼠胰脏IRS-1与IRS-2的mRNA水平的影响采用2-ΔΔCT法计算正常组与针刺组相对模型组的IRS-1与IRS-2的mRNA表达水平。见图1～2。
       图1与图2显示胰脏组织存在IRS-1与IRS-2基因的mRNA表达，图1显示正常组IRS-1 mRNA表达量约为模型组的2.17倍，针刺组IRS-1 mRNA表达量约为模型组的1.5倍，3组差异非常明显。图2显示3组IRS-2的mRNA差异不是非常明显。
       4  讨论
       肥胖症( obesity )是指身体内所含的脂肪组织超出了维持生理正常功能的比例，是一种常见的代谢症候群( MS )［7］。许多研究结果表明，高脂饮食诱导的肥胖大鼠呈现胰岛素抵抗［8,9］。胰岛素抵抗( IR )是指胰岛素效应器官对胰岛素生理作用不敏感的一种病理生理状态,表现为靶器官,如肝脏、肌肉、脂肪组织等对胰岛素介导的葡萄糖代谢作用不敏感。它是糖尿病、高血压病、高血脂及心血管疾病等疾病的独立危险因素［10～12］。本研究表明，在饮食诱导的肥胖大鼠体质量，血糖及血清中胰岛素水平明显升高,表明肥胖模型组大鼠出现了高胰岛素血症，肥胖机体存在着胰岛素抵抗（IR）。经过针刺治疗后,针刺组体质量，血糖及血清中胰岛素均降低，与模型组比较差异有显著性意义(P<0.01)。说明针刺可以有效降低肥胖大鼠的体重、血糖及血中过高的胰岛素含量，针刺有效地改善肥胖大鼠的血糖异常，提高胰岛素的敏感性。
       近年研究证实，β细胞也存在胰岛素信号转导通路分子的表达［13～16］。Muller等应用ＲＮＡ干扰技术使人类胰岛细胞胰岛素受体基因表达下降，可以抑制葡萄糖刺激的胰岛素基因的表达，提示β细胞上胰岛素信号分子对胰岛素分泌有重要作用［17］。Xu及Kulkarni 等研究发现,胰岛β细胞胰岛素信号转导对胰岛素的分泌和合成具有正反馈调节作用,选择性β细胞胰岛素受体（IRc）基因敲除鼠也表现为胰岛素Ⅰ相分泌障碍，提示胰岛β细胞胰岛素信号转导的障碍可能是胰岛素Ⅰ相分泌障碍的重要原因之一［18，19 ］。
       国内外文献对高脂饮食诱导的肥胖大鼠胰岛的胰岛素信号转导系统的报道较少。本研究应用实时荧光定量PCR的方法检测了胰岛组织IRS-1，IRS-2 mRNA的表达。结果显示肥胖机体胰岛IRS-2 mRNA表达无明显降低，IRS-1 mRNA的表达降低53.9％。 这与邬云红等研究结果相反，即在具有外周IR的肥胖鼠，IRS-2表达的显著降低，但IRS-1表达的改变差异无统计学意义［20］。可能由于两个实验方法不一致，还有待进一步研究。但两实验均表明胰岛的IR发生在受体和受体后水平。经针刺干预后胰岛IRS-1 mRNA的表达升高50%。结果提示，针刺可改善胰岛组织中胰岛素受体后信号传导，且其主要作用位点可能在IRS-1蛋白酪氨酸磷酸化环节。
       综上所述，本实验初步阐明了高脂饮食诱导的肥胖大鼠胰岛素表达异常，肥胖机体在具有外周IR的同时也存在胰岛细胞的IR。针刺可通过改善胰岛素信号转导而防治胰岛素抵抗的作用机理，为临床应用针刺防治胰岛素抵抗提供了理论依据。
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