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       【关键词】  清咽片；,,靛蓝；,,含量测定；,,高效液相色谱
       摘要：目的建立反相高效液相色谱法测定清咽片中靛蓝的含量。方法采用AichromBondAQ C18色谱柱；甲醇水乙酸（64∶36∶0.5）为流动相，流速0.8 ml・min-1，紫外检测波长为285 nm。结果靛蓝可与其他主要成分分离，靛蓝与峰面积呈良好线性关系，线性范围在0.029 4~0.588 μg，回归方程为Y=26 644.73 X-1 288.56，r=0.999 9，样品平均回收率为99.51%，RSD=0.72%（n=6）.结论该方法准确、快速、灵敏、重现性好。
       关键词：清咽片；  靛蓝；  含量测定；  高效液相色谱
       Determination of Indigo in Qingyan Tablet by RPHPLC
       DAI Chunhong, JIN Xiangqun, SUN Mingqian, XIAO Feng, SUI Zhigang
       (Phamac eutical College of Jilin University, Changchun 130021,China; Chemical College of Jilin University, Changchun 130061, China)
       AbstractObjectiveTo establish a method using RP-HPLC for determination of the content of Indigo in Qingyan tablet.MethodsThe content of Indigo Naturalis was determined by reverse phase HPLC at 285nm on a AichromBond-AQ C18 column(4.6 mm×250 mm,5 μm)with methanol-water-acid(64∶36∶0.5) as mobile phase and flow rate of 0.8ml・min-1.ResultsThe linear range of calibration curve was 0.029 4~0.588μg(r=0.999 9),the average recovery was 99.51% with RSD of 0.72%(n=6).ConclusionThe method is simple,accurate and can be used for the quality study of Qingyan Tablet.
       Key words:Qingyan Tablet;  Indigo blue;  Detemination;  HPLC
   
　　清咽片是由桔梗、硼砂、寒水石、青黛、冰片、薄荷脑、诃子（去核）、甘草、甘草霜等中药组成的复方制剂。具有清凉解热、生津止渴之功效，用于咽喉肿痛、声嘶音哑、口干舌燥、咽下不利的治疗。青黛为方中君药，靛蓝（Indigo）是其中主要成分，具有抗菌消毒、祛腐生肌之疗效，是该药主要有效成分之一，因此选为测定指标。靛蓝含量测定方法有：紫外分光光度法［1］、直接比色法［2~4］、高效液相色谱法［5，6］等。由于本品为复方制剂，成分复杂，文献报道方法欠佳，故本实验采用高效液相法测定靛蓝的含量。
       　　1  器材
       岛津 LC-10AT高效液相色谱仪；岛津SPD-10A紫外检测器；2010双通道色谱工作站；KQ-250D数控超声波清洗器。靛蓝（indigo商品号：0756-200211）对照品由中国药品生物制品检定所提供，甲醇为色谱纯（美国 Fisher公司生产），氯仿为分析纯，水为重蒸水，清咽片由长春银诺克药业提供。
       　　2  方法与结果
       2.1  对照品溶液的制备精密称取经五氧化二磷减压干燥24 h的靛蓝对照品适量，加氯仿制成每毫升含0.029 4 mg的溶液。
       2.2  供试品溶液的制备取重量差异项下的本品20片，除去糖衣，研细，取2.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加氯仿25 ml，精密称定重量，超声处理1 h（每隔10 min振摇），取出放至室温，再称定重量，加氯仿补足减失的重量，过滤，滤液用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，取续滤液，即得。
       2.3  色谱条件色谱柱为岛津公司产AichromBond-AQ C18柱（4.6 mm×250 mm,5μm）；以甲醇-水-乙酸（64∶36∶0.5）为流动相，流速0.8 ml・min-1，紫外检测波长为285 nm，理论板数按靛蓝峰计算应不低于3 000。
       2.4  标准曲线的绘制精密吸取上述对照品溶液1，5，10，15，20 μl依照上述色谱条件进行分析，以进样体积（μl）为横坐标，以靛蓝的峰面积值为纵坐标，绘制标准曲线，计算得到的回归方程为：Y=26 644.73X-1 288.56，r=0.999 9；线性范围为0.029 4~0.588 μg。
       2.5  精密度实验精密吸取同一供试品溶液20 μl，重复进样6次，测定靛蓝的峰面积，计算面积的RSD值为0.58%。
       2.6  重现性实验取批号为20051001的清咽片适量，6份，除去糖衣后，研细，精密称定，按“2.2项”下的方法操作，制备供试品溶液，测定清咽片中靛蓝的含量，计算含量的RSD值为0.58%。
       2.7  稳定性实验分别精密吸取放置1，2，4，6，8 ，12 h的供试品溶液，测定清咽片中靛蓝的峰面积，计算峰面积的RSD值为0.77%，表明供试品溶液至少在12 h内稳定。
       2.8  加样回收率实验精密称取靛蓝对照品适量，加入到已知靛蓝含量的清咽片（批号：20051001，靛蓝含量为0.0467%）中，按“2.2项”下方法操作，制备供试品溶液，测定清咽片中靛蓝的含量，结果靛蓝的平均回收率为99.51%,RSD为0.72%,n=5。
       2.9  清咽片中靛蓝的含量测定按“2.2项”下方法操作，制备供试品溶液，测定10批清咽片中靛蓝的含量。结果见表1。
       表1  清咽片中靛蓝的含量测定结果(略)
 
　　测定结果表明，清咽片中靛蓝含量基本稳定，故在平均含量的基础上，总含量上浮及下浮20%制定本制剂含量限度，限定每片含靛蓝的量不得低于0.11 mg。
       　　3  讨论
       3.1  2005年版《中国药典》采用紫外分光光度法测定靛蓝的含量，本实验采用高效液相法测定，操作简单，重现性好。通过全波长扫描得到靛蓝在285 nm处有最大吸收，因此选择285 nm为检测波长。
       3.2  曾采用甲醇超声1 h，甲醇加热回流2 h，氯仿超声1 h，氯仿加热回流2 h 制备供试品溶液，结果发现，以甲醇为溶媒制备供试品溶液时，其它成分干扰较大，而且提取不完全；而以氯仿为提取溶媒时干扰成分少，提取完全，因此采用氯仿进行提取。在进行测定时发现，氯仿超声提取1 h与氯仿加热回流2 h，靛蓝的含量基本无差异，因此采用方便快捷的超声提取方法。
       3.3  方法学考察表明：该含量测定方法操作简单，可行性强，重现性好。
       　　参考文献：
       ［1］  国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，2005：158..
       ［2］  李清化.青黛的化学成分［J］.植物学报，1987，29（1）：67.
       ［3］  邓柏林.青黛中靛蓝与靛玉红直接比色测定法［J］.中草药，1986，17（4）：19.
       ［4］  袁俊贤，邵依嗣.青黛中靛蓝含量的比色测定［J］药物分析杂志，1985，5（3）：164.
       ［5］  邓柏林.柱层析分光光度法测定中药青黛中靛蓝与靛玉红含量［J］中草药，1981，12（6）：11.
       ［6］  曹  红，刘  云.青黛含量测定方法的研究［S］.中国药品标准，2002：2.
       (吉林大学药学院，吉林 长春  130021；吉林大学化学院，吉林 长春  130061)